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你真的了解 TA 克隆嗎？

2022年04月26日 11:38上海遠慕生物科技有限公司點擊量：840

　　首先，TA 克隆是用于 PCR 產(chǎn)物的克隆和測序。原理是利用 Taq 酶能夠在 PCR 產(chǎn)物的 3’末端 加上一個非模板依賴的 A，而 T 載體是一種帶有 3’T 突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR 產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點中。
 
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　　那么在你做 TA 克隆時，需要準(zhǔn)備的前期工作是什么呢？
 
　　1 、設(shè)計引物 P 出你的目的基因
 
　　不管你是手動設(shè)計還是軟件設(shè)計或是直接引用別人已經(jīng)發(fā)表文章用到的引物，只要能 P 出 來目的片段就行，在 PCR 的結(jié)果中需要注重 P 出來的濃度，要達到濃度高的要求一方面是在前期的樣本準(zhǔn)備本身就得到高濃度。
 
　　比如要 P 出一種病毒的某部分基因，那么在病毒的 RNA 提取時，就必須保證該病毒的病變效果明顯，才有可能得到高濃度的 RNA，繼而或者逆轉(zhuǎn)錄得到高濃度的 cDNA。
 
　　另一方面是在 PCR 的條件時對于退火溫度等的條件把握，如果有一些引物二聚體存在，那么可以嘗試提高退火溫度，延長一點延伸時間，但具體如何使得 PCR 跑出來又亮又單一，還是需要摸摸條件。
 
　　2 、切膠回收產(chǎn)物
 
　　在紫外儀下切下目的產(chǎn)物，注意一定要快準(zhǔn)狠，盡快切下，并盡可能少的切下多余的膠，回收利用的試劑盒一般嚴(yán)格按照試劑盒操作應(yīng)該沒有什么問題。回收之后測濃度，準(zhǔn)備下一步。
 
　　3 、連接
 
　　這一步驟就直接按照選擇的 T 載體說明書來操作了，需要注意的是，在上一步測完回收濃度后，如果濃度較低，建議在試劑加量上盡量加大 DNA 的用量。
 
　　一般來說回收之后就趕緊地進行連接，但是由于有時候可能中間時間耽誤了，沒能及時連接， 那么在這之前可以補加兩個步驟，一是加 A 尾，二是純化回收的產(chǎn)物。
 
　　但是在長期的嘗試中，我發(fā)現(xiàn)純化與否和手動加 A 尾并不怎么影響連接效果。
 
　　4 、轉(zhuǎn)化鋪板
 
　　這個步驟用來篩選重組子，長出來的菌多不是好事，菌少也不是壞事，也許就只長兩個單克隆菌，但這兩個都是陽性重組子，反正只要挑到正確的就行。
 
　　5 、菌液 PCR 鑒定
 
　　一般挑菌之后在 EP 管中搖個 3 到 5 個小時就可以進行菌液 PCR 了，一般來說這樣的搖菌時間能最保證接近真實的陽性結(jié)果，菌液 PCR 之前有人建議說要煮沸幾分鐘再 P，但其實直接取搖菌的 1ul 作為模板，進行 PCR 就可以了，條件與之前 P 產(chǎn)物的條件一致。
 
　　6 、酶切鑒定
 
　　酶切位點的選擇必須要確保目的基因中沒有這個位點，而載體與目的基因連接附近有位點。在進行酶切的時候是要摸酶切時間的，是否已經(jīng)切開跑一個電泳看看。
 
　　7 、測序鑒定
 
　　如果實在是覺得上面兩個鑒定都拿不準(zhǔn)，那也可以嘗試測序，如果測序結(jié)果與目的基因能夠*比對匹配上，那么也說明就是連接上了。
 
　　其實 TA 克隆是非常簡單的克隆，先天的條件 A 和 T 都已經(jīng)具備了，除非你手實在不順，連個 2500bp 以下的都是沒什么問題的。
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