實(shí)驗(yàn)：免疫核糖核酸的制備及鑒定實(shí)驗(yàn)

　　實(shí)驗(yàn)概要

　　本實(shí)驗(yàn)通過免疫動(dòng)物，制備了免疫核糖核酸(iRNA)，并進(jìn)行了鑒定。

　　實(shí)驗(yàn)原理

　　iRNA是用某種抗原免疫動(dòng)物后，從免疫動(dòng)物的免疫活性細(xì)胞中提取出來的RNA。它具有傳遞相應(yīng)抗原特異性免疫信息的能力，因而注入體內(nèi)后，可發(fā)揮對(duì)該抗原的免疫清除作用。

　　iRNA的免疫學(xué)作用機(jī)理目前尚無定論，一般認(rèn)為iRNA具有直接模板作用，即iRNA以mRNA的形式在受體細(xì)胞中起模板作用，從而合成與免疫反應(yīng)有關(guān)的蛋白質(zhì)，使正常非致敏的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成致敏淋巴細(xì)胞。另外，也有人認(rèn)為iRNA具有逆轉(zhuǎn)錄作用、免疫調(diào)控作用及“超抗原”作用等。

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　1. 動(dòng)物免疫

　　1) 抗原制備：根據(jù)欲制備的免疫核糖核酸的目的不同，采用不同的抗原。

　　如欲制備抗乙肝iRNA，可采用乙肝疫苗，每20μg乙肝疫苗，加1ml弗氏不佐劑(液體石蠟8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg，充分混勻并乳化合格后備用。

　　2) 動(dòng)物選擇及免疫：大量制備時(shí)，多選用綿羊或山羊，小量制備時(shí)，可選用家兔或豚鼠，所用動(dòng)物應(yīng)健壯無病。免疫方法為背部及兩肘窩多點(diǎn)皮下注射上述乳化疫苗，同時(shí)腹腔注射10μg乙肝疫苗，其后每周腹腔注射20μg，共4次。

　　3) 效價(jià)測定及臟器采?。旱?次免疫后1周，靜脈采血，分離血清，用ELISA測效價(jià)，如效價(jià)在1:800以上即合格。處死動(dòng)物，采取脾臟及淋巴結(jié)，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2. iRNA的提取(熱酚法)

　　1) 粗提：將脾臟及淋巴結(jié)去掉結(jié)締組織及被膜，用生理鹽水洗凈，切碎，洗去血液，擠干。每200g組織加200ml鹽水，置高速組織搗碎機(jī)中制成勻漿(以8000～10 000r/min勻漿兩次，每次1～2min)。

　　向上述勻漿中加入b酚溶液(b酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml，混勻，置60℃水浴振蕩10min，置冰浴冷卻10min，以3500r/min離心30min，取上清液置冰浴中。

　　2) 精制：在上述上清中加入半量b酚溶液，室溫下劇烈振蕩10min，以3500r/min離心20min，取水相。加2～3倍體積95%酒精，置冰箱(普通或低溫冰箱均可)過夜。以3500r/min離心30min，棄上清，取沉淀。取少許沉淀，溶于適量水中，測DNA含量及蛋白質(zhì)，合格后可做下步。

　　3. 除菌、分裝及凍干

　　取上述沉淀，加適量三餾水溶解，取少量用紫外分光光度計(jì)測RNA含量，按測定結(jié)果，將上述溶液用三餾水稀釋至約2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐，混勻。用微孔濾膜濾過除菌，分裝(1mg/支)，凍干，封口，待檢。

　　4. 檢定

　　1) pH值，取本品2支，溶于10ml餾水中，其pH值應(yīng)為68～80。

　　2) 吸收度，取本品溶于餾水中，用紫外分光光度計(jì)檢測，其OD260/OD280應(yīng)不小于20。

　　3) DNA含量測定，用標(biāo)準(zhǔn)DNA作對(duì)照，以紫外法測定，DNA含量不大于5%。

　　4) RNA含量測定，取本品3支，分別溶解于50ml餾水中，按《中國藥典》二部附錄法測定，三支含量均應(yīng)在095mg以上。

　　5) 異常毒性，取本品，以注射用生理鹽水制成05mg/ml溶液，家兔可靜脈注射，應(yīng)無異常反應(yīng)。

　　6) 無菌檢查，取本品3支，溶于6ml無菌水中，分別接種于普通培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)基及霉菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長。

　　7) 活性測定，采用白細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)。其原理為正常白細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，可粘附于玻璃表面，而用iRNA處理過的白細(xì)胞，其粘附于玻璃表面的能力則被抑制，測知該粘附抑制率，即知iRNA活性。方法為：取綿羊抗凝血，分離白細(xì)胞，將白細(xì)胞調(diào)節(jié)為在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上每大格內(nèi)含40～80個(gè)細(xì)胞的濃度。取細(xì)胞懸液，加等體積iRNA溶液，37℃水浴后，移入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，置37℃溫育后，用鹽水沖洗、計(jì)數(shù)。同時(shí)作正常白細(xì)胞(不加iRNA)對(duì)照。計(jì)算白細(xì)胞粘附抑制率，如大于20%為合格。

　　注意事項(xiàng)

　　1. 溫度對(duì)iRNA活性影響較大。提取過程須加熱時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間。提取間歇時(shí)，應(yīng)置冰浴中。

　　2. 嚴(yán)格控制RNA酶。RNA酶分布廣泛，如污染RNA酶可將iRNA降解而失去活性。因此，各步均應(yīng)嚴(yán)格控制，如器皿泡洗后，應(yīng)干熱滅菌，操作者應(yīng)帶手套，提取過程中，可加入RNA酶抑制劑等。

　　3. RNA的提取主要有熱酚法及冷酚法兩種，前者產(chǎn)率高，但易引起RNA的變性和降解;冷酚法(0～4℃)不易引起RNA的變性和降解，但產(chǎn)率較低。

　　4. b酚為冰狀固體，如顏色變紅，是為氧化之故，應(yīng)廢棄。b酚加熱融化后，方可配制，配制時(shí)，配制者應(yīng)注意防護(hù)。如b酚配制后須較長時(shí)間存放，應(yīng)加入8羥基喹啉以抗氧化。

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