Trizol法提取總RNA的流程及原理

　　提取原理：Trizol試劑的主要成分是bf。bf的主要作用是對細胞進行裂解，從而使細胞當中的蛋白質以及核酸物質解聚而得以釋放。bf雖然可以有效的使蛋白質變性，但它不能抑制RNA酶的活性，因此Trizol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase(即RNA酶)。

　　Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品的裂解液或勻漿中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿(CHCl3)后離心，樣品能分成水樣層和有機層。而RNA存在于水樣層中。在收集上面的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀的方法來還原。在除去水樣層之后，樣品中的核酸和蛋白也能相繼以沉淀的形式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能析出有機層的蛋白。

　　Trizol試劑不但可用于小量樣品(組織：50-100mg;細胞：5×106)，也可用于大量樣品(組織≥1g或細胞≥107)，對動物、植物、細菌、血液提取都適用，可同時處理大量不同樣品。反應迅速，提取的總RNA沒有DNA和蛋白質污染，可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保護分析等。

　　本試劑帶有顏色，以便于區分水相和有機相，同時最大限度的保持RNA的完整性。保存條件：2-8℃，避光保存12個月。

　　實驗前需要準備的試劑：

　　Trizol，氯仿，異丙醇，75%乙醇(用RNase-Free水配制)，RNase-Free水。

　　實驗前需要準備的物品：

　　1ml注射器，1.5ml EP管(DEPC處理過)，大、中、小號槍頭(DEPC處理)

　　樣品前處理注意點：

　　1.選擇新鮮血液。

　　2.選擇生長旺盛的組織。

　　3.選擇新鮮的幼嫩組織。

　　4.選擇處于生長旺盛的時期的細胞。

　　RNA純化要求：

　　1.純化后不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的物質。

　　2.排除有機溶劑和金屬離子的污染。

　　3.蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降到程度。

　　4.排除DNA分子的污染。

　　RNA提取的注意事項：

　　1.杜絕外源酶的污染。

　　(1)嚴格戴好口罩，手套。

　　(2)實驗涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要處理。

　　(3)實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保RNase-Free。

　　2.阻止內源酶的活性。

　　(1)選擇合適的勻漿方法。

　　(2)選擇合適的裂解液。

　　(3)控制好樣品的起始量。

　　3.明確自己的提取目的。

　　(1)任何裂解液體系在接近樣品最大起始量時，提取成功率急劇下降。

　　(2)RNA提取成功的經濟的標準是后續實驗的一次成功，而不是得率。

　　Rnase污染的來源

　　手指頭，槍頭，水/緩沖液，實驗臺面，內源Rnase，RNA樣品，質粒提取，RNA保存，陽離子(Ca，Mg)，后續實驗所用的酶。

　　操作流程：

　　1.樣品的處理：

　　(1)培養細胞：收獲細胞1-5×107，加入1ml Trizol(異硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁邊取出白細胞即刻加入Trizol)，混勻;用1ml注射器反復抽取(約30次)以破裂細胞及剪切DNA，室溫靜置5min(使核酸蛋白復合物分離)。

　　(2)組織：取50-100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置5min。

　　2.可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質(肌肉，植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

　　3.加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15-30s，靜置2-3min。

　　4.4℃離心，12000g×15min。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅，即大約600 ul。

　　5.小心吸取上清至一新的DEPC處理過的1.5ml EP管中(如要分離DNA和蛋白質可保留有機相)，加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。

　　6.4℃離心，12000g×10min。離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。

　　7.棄上清，于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml，振搖，充分洗滌沉淀。

　　8.4℃離心，12000g×5min。

　　9.棄上清，短暫離心，小心吸取棄去上清。

　　10.加入適量(20μl)DEPC (RnaseFree)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。

　　11.取2μl進行電泳，其余-80℃保存。

　　溫馨提示：

　　1.關于液氮研磨：

　　萬事開頭難，液氮研磨是最開始的步驟，也是最辛苦的步驟。很多女孩子都怕液氮，畢竟是零下近200度的東西，當然不是鬧著玩的。不過只要小心操作，一般沒啥問題，呵呵。找一個保溫杯，倒出一些液氮，然后再往研缽里倒。研磨的時候多加幾次液氮，組織會慢慢變脆，就會好研一些，對于一些含水量比較大，很硬的組織，準備刀片，切成小塊后再研磨，一定研磨充分，不要求研磨成奶粉狀，但至少得看不到明顯的顆粒，這樣Trizol才能充分和組織接觸，快速裂解組織，也能防止組織的降解(Trizol內含RNA酶抑制劑)。

　　2.關于組織量：

　　研磨前最后稱一下組織的重量，畢竟1ml的Trizol最多只能裂解100mg的組織。Trizol里面是含有RNA酶抑制劑的，如果組織過量，Trizol無法浸潤組織無法裂解組織，多余組織內的RNA酶等物質會導致RNA的降解。這是RNA降解的很重要的原因。

　　3.關于提取步驟：

　　標準Trizol提取步驟為液氮研磨--加入Trizol裂解--加入氯仿抽提--離心--加入異丙醇沉淀--離心--酒精洗滌--離心。

　　因為提取的組織，在加入Trizol后增加了一步簡短的離心，可以幫助去掉一些無法降解的組織，比如纖維和雜質之類，然后取上清再加入氯仿，可以幫助提高氯仿的效率。然后就是在加入Trizol后，可以將裂解液放到-80凍存半小時以上，據說凍融過程中可以再次幫助更加充分的裂解細胞，分離蛋白和RNA。

　　4.關于各步驟的時間：

　　標準的時間是

　　a.液氮研磨(沒時間要求，只要組織不化就好,一般一個組織十分鐘左右，女孩子可能時間長一些，畢竟體力活)

　　b.加入Trizol裂解5-10分鐘(我覺得還是10分鐘比較好，有人說這步要放在冰上，但是我的經驗室溫就可以，室溫更有利于Trizol發揮作用，而且畢竟Trizol含有RNA酶抑制劑，不用擔心RNA降解)

　　c.加入氯仿室溫靜置15分鐘

　　d.離心15分鐘，這是關鍵的一步，離心后分成三層，RNA在上清里，所以離心管從離心機拿出來的時候要輕巧，以免管內物質震蕩導致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定一定輕，切忌吸取太多，少量即可，吸到400-500ul就OK了，再多就容易碰到下層沉淀了。

　　e.加入異丙醇靜置10min，然后離心10min。

　　f.用75%酒精洗滌沉淀，幫助分離剩余的有機試劑(剩余有機試劑過多會影響OD值和PCR反應)，所以酒精盡量多加一些，一般說明書沒有說明這一步的時間，只是說劇烈渦旋震蕩，我的經驗是一定把沉淀彈起來，讓浮在酒精中，然后放1-2min，讓酒精充分接觸沉淀，充分溶解有機試劑，然后再離心。

　　g.加入DEPC處理水，組織提取出來的量還是挺大的，雖然不是很純，所以溶解液還是不能太少，至少要50ul，之前一個大姐給我說加20ul就可以，結果濃度直接高的光度計測不出來了。而且濃度太高跑電泳時也跑不開，沒法鑒定。

　　5.關于RNA電泳鑒定：

　　RNA很脆弱，跑電泳的時候也容易降解，但是也沒必要就非得用嶄新配置的TBE電泳液，電泳液不要太臟就可以。電泳點樣量不要太大，畢竟組織提取的RNA純度不會很高，多少還有一些雜質，太多的話不僅容易使RNA降解，還有影響電泳效率，跑不開。

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