知識詳解：細胞培養常見問題及解答

　　1. 如何選用特殊細胞系培養基?

　　培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始。

　　2. 何時須更換培養基?

　　視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上的更換時間，按時更換培養基即可。

　　3. 可否使用與原先培養條件不同的培養基?

　　不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基，若驟然使用和原先提供的培養條件不同的培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

　　4. 可否使用與原先培養條件不同的血清種類?

　　不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

　　5. 何謂FBS, FCS, CS, HS ?

　　FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

　　6. 培養細胞時應使用5% 或10% CO2?或根本沒有影響?

　　一般培養基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作為pH 的緩沖系統，而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時，則應使用5% CO2 培養細胞。

　　HBS和EBS 的主要差別在于ts氫鈉的水平，在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。ts氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液，如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

　　8. 什么是細胞的接種密度?

　　依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

　　9. 懸浮性細胞應如何繼代處理?

　　一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

　　10. 冷凍管應如何解凍?

　　取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

　　11. 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO?

　　除少數特別注明對DMSO 敏感的細胞外，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，在解凍之后，應直接放入含有10-15 ml新鮮培養基的培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。

　　12. 附著性細胞繼代時所使用的trypsin-EDTA 濃度?應如何處理?

　　一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機會。

　　13. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速?

　　回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘，過高的轉速，將造成細胞死亡。

　　14. 細胞冷凍培養基的成份為何?

　　動物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

　　15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?

　　冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4℃，避免反復冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質，并可減少污染的機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。

　　16. 冷凍保存細胞的方法?

　　冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

　　冷凍保存方法二：冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

　　17. 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?

　　冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

　　18.培養基中是否須添加抗生素?

　　除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

　　19. 應如何避免細胞污染?

　　細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的**方法。當然，適當添加抗生素也是防止細胞污染的途徑，Invivogen公司就能提供多種細胞抗生素類產品：

　　Primocin™——原代細胞抗生素

　　Primocin™是專門設計用于保護原代細胞免受微生物污染的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體和真菌均有殺傷作用。Primocin™對原代細胞沒有毒性，因為其作用的靶標只存在于微生物上。其中細菌的靶標為DNA解旋酶和原核細胞核糖體亞基30S和50S;真菌的靶標為麥角固醇(一種只發現于真菌和酵母細胞膜的分子)。

　　產品名稱

　　規格

　　產品編號

　　Primocin™

　　500 mg (10 x 1 ml)

　　ant-pm-1

　　1 g (1 x 20 ml)

　　ant-pm-2

　　Normocin™——細菌、真菌、支原體多效抗生素

　　Normocin™具有抗細菌、真菌、支原體三種微生物的作用，其包含兩種成分可通過阻斷DNA復制和蛋白合成來殺滅細菌和支原體。第三種成分通過干擾細胞膜離子交換來清除酵母和真菌。Normocin™推薦使用濃度為100 mg/ml，該濃度對細胞沒有毒性。

　　產品名稱　　規格　　產品編號

　　Normocin™

　　500 mg (10 x 1 ml)

　　ant-nr-1

　　1 g (1 x 20 ml) ant-nr-2

　　Fungin™——真菌特異性抗生素

　　Fungin™是Pimaricin(匹馬菌素)的可溶性形式，Pimaricin是十九世紀五十年代發現的多烯抗真菌試劑，可通過干擾細胞膜離子交換的方式殺滅酵母、霉菌和真菌。Fungin™十分穩定，在37°C放置6天仍具有活性。與Amphotericin B(lx)需要溶于有毒的脫氧膽酸鹽不同，Fungin™是水溶性的，對細胞無毒性，并且不會影響細胞代謝，推薦使用濃度為10 mg/ml - 50 mg/ml。

　　產品名稱　　規格　　產品編號

　　Fungin™

　　75 mg (5 x 1.5 ml)

　　ant-fn-1

　　200 mg (1 x 20 ml) ant-fn-2

　　20. 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理?

　　原則上：直接滅菌后丟棄之。

　　當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

　　高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

　　(1) 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

　　(2) 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。

　　(3) 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。

　　(4) 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。

　　(5) 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

　　(6) 重復步驟4。

　　(7) 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。

　　21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀?

　　不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

　　22. 支原體污染會對細胞培養有何影響?

　　支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數，代謝及研究的任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果的數據方有意義。

　　23. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理?

　　直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染

　　Plasmocin™——支原體預防與去除利器

　　Plasmocin™是目前全球*受科研工作者歡迎的支原體抗生素之一。其包含大環內酯物及對苯二酚兩種主要成分，可有效作用于支原體復制的蛋白合成階段和DNA復制階段，只需兩周即可清除支原體污染，并且不會影響細胞本身代謝;其ty的轉運載體可以將有效成分轉運到細胞內，故對胞內支原體和胞外游離的支原體都十分有效。此外，低濃度的Plasmocin™對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌也有一定的清除作用。

　　Plasmocin™ Treatment (ant-mpt)

　　用于清除支原體污染，使用濃度為25 ug/ml,2周即可清除支原體。

　　Plasmocin™ Prophylactic (ant-mpp)

　　用于預防支原體污染，定期添加于細胞培養基中，使用濃度為2.5 - 5 ug/ml。

　　產品名稱　　規格　　產品編號

　　Plasmocin™ treatment

　　50 mg (2 x 1 ml)

　　ant-mpt

　　Plasmocin™ prophylactic

　　25 mg (10 x 1 ml)

　　ant-mpp

　　Plasmocure™——強力清除具有Plasmocin™抗性的支原體

　　據報道在極少數情況下，有些支原體對Plasmocin™ 具有抗性?；诖?，InvivoGen又開發了第二款支原體抗生素Plasmocure™。Plasmocure™采用不同于Plasmocin™作用機制的兩種抗生素來殺滅支原體，處理兩周時間即可清除這些頑固支原體。在處理過程中有輕度的細胞毒性，但支原體清除后細胞系可恢復。Plasmocure™推薦使用濃度為50 mg/ml。

　　產品名稱　　規格　　產品編號

　　Plasmocure™

　　100 mg (1 x 1 ml)

　　ant-pc

　　24. CO2 培養箱的水盤如何保持清潔?

　　定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

　　25. 為何培養基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性?

　　培養基保存于4℃冰箱中，培養基內的CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2， 以調整pH 值。

　　26. 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同?

　　不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異。

　　27. 購買的細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少的情形?

　　研究人員在冷凍細胞的培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

　　28. 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?

　　研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于-80℃太久。

　　29. 如何避免沉淀物的產生?

　　我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

　　(1) 解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉淀物。

　　(2) 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發生。

　　(3) 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

　　(4) 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

　　(5) 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

　　ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒