感受態(tài)菌的制備原理與操作步驟

2024年06月28日 09:32上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司點(diǎn)擊量：307

1．目的
學(xué)會(huì)CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

2．原理
細(xì)菌在0℃ CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。

3．器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。

4．試劑
E. coli XL1-Blue，LB培養(yǎng)基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無(wú)菌ddH2O

5．實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（滅菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（滅菌），無(wú)菌ddH2O，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。

6．操作步驟
（1）取一支無(wú)菌的搖菌試管，在超凈工作臺(tái)中加入2ml LB（不含抗菌素！）培養(yǎng)基。
（2）從超低溫冰柜中取出XL1-Blue菌種，放置在冰上。在超凈工作臺(tái)中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
（3）取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50ml LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h，測(cè)定OD600為0.375（<0.4~0.6，細(xì)胞數(shù)<108/ml，此為關(guān)鍵參數(shù)！）。以下操作除離心外，都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
（4）將菌液分裝到1.5ml預(yù)冷無(wú)菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm離心 10min。
（5）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。
（6）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。
（7）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，超凈工作臺(tái)中按每管100ml分裝到1.5ml離心管中。可以直接用作轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，或立即放入-80℃超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。
（8）在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面。

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