臨床微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常能夠分離到一些有意義的菌種，但接種在平板上的細(xì)菌放4℃冰箱只能保存數(shù)天，并且細(xì)菌在培養(yǎng)基上移種3次后，其形態(tài)、菌落、毒力等均易發(fā)生變異，監(jiān)測(cè)日常工作的室內(nèi)質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)菌株也需要長(zhǎng)期留存。所以盡可能長(zhǎng)期有效地留存菌種對(duì)于系統(tǒng)地分析當(dāng)前流行株的生物學(xué)、分子生物學(xué)特征及耐藥性變遷，醫(yī)院感染病原學(xué)調(diào)查、新藥臨床研究都十分重要的意義。
本文介紹幾種常用的菌種保存方法，如下：
一、常規(guī)保存法
該法操作簡(jiǎn)單，只需普通冰箱保存，每個(gè)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室均可采用。但缺點(diǎn)是留存時(shí)間短，傳代頻繁，菌種易變異。
二、半固體穿刺保存法
用穿刺接種法將細(xì)菌培養(yǎng)物接種于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng) 37℃18-24h培養(yǎng)后，加一層無(wú)菌的液體石蠟，厚度約為 1cm，置冰箱保存。腸道桿菌及葡萄球菌等，一般可保存3-6個(gè)月。當(dāng)需傳代移種時(shí)，將半固體菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再取菌移種于新的培養(yǎng)基。將沾有少量液體石蠟的接種環(huán)浸于 95％酒精中片刻，再燒灼滅菌以免直接在酒精燈上燒灼時(shí)，液體石蠟四處濺散而引起污染。如保存副溶血性弧菌可加入NaCl制成3.5%高鹽半固體，在室溫下可保存 1個(gè)月。
三、斜面保存法
?、牌胀ō傊泵姹４娣ǎ浩咸亚蚓?、腸道桿菌等對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高的一股細(xì)菌可接種于普通瓊脂斜面上，斜面底部應(yīng)加少許無(wú)糖肉膏液，以防干涸 (但變形桿菌"OX"及傷寒桿"O"菌株宜接種于干燥的瓊脂斜面以防變異)。用橡皮塞塞緊，經(jīng)37℃18-24h培養(yǎng)后，存放于 4℃冰箱中，一般可保存3-6個(gè)月。
?、蒲涵傊泵姹４娣ǎ烘溓蚓胺窝浊蚓葘?duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌應(yīng)接種于血液瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)后，放4℃冰箱保存。鏈球菌須半個(gè)月至1個(gè)月移種一次，肺炎球菌則須 4d移種一次。
⑶雞蛋斜面保存法：將細(xì)菌接種于雞蛋斜面上，經(jīng) 37℃18-24h培養(yǎng)后，加無(wú)菌液體石蠟至斜面浸液，再超出約1cm，置4℃冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙門氏菌及其它含表面抗原的細(xì)菌，可保存3-6個(gè)月。
⑷呂氏血清斜面：白喉棒狀桿菌可保存在該培養(yǎng)基上，其成份為 1 %葡萄糖肉湯 (pH7.4) 1份，無(wú)菌牛血清或兔血清3份。白喉棒狀桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速、旺盛，菌體形態(tài)典型，如在培養(yǎng)基中再加入5%-10%的中性甘油，則培養(yǎng)出的白喉棒狀桿菌異染顆粒更為明顯，單24小時(shí)后即衰老成為多形態(tài)，很少有異染顆粒，菌體粗大3-4倍，置4℃可保存2周至1個(gè)月。
四、砂土管保存法
適用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌
將過(guò)篩后的中性細(xì)砂烘干，裝入小試管內(nèi)約lcm高，塞以棉塞，滅菌烘干備用。用無(wú)菌生理鹽水洗下培養(yǎng)基上的細(xì)菌培養(yǎng)物，制成菌懸液。然后吸此菌懸液約0.5ml注入砂土管內(nèi)，以砂土全部浸濕為度。塞好棉塞，放入干燥器內(nèi)抽干。然后放在裝有氯化鈣(吸水劑)的干燥瓶?jī)?nèi)，置冰箱保存?zhèn)溆?。需用時(shí)可取一接種環(huán)砂土接種于適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。
五、低溫冷凍保存法
實(shí)驗(yàn)室必須配備-20℃以下低溫冰箱，冰箱溫度越低，保存的時(shí)間越長(zhǎng)。
六、濾紙片低溫冷凍保存菌種方法
將新華濾紙片剪成3mm×3mm，經(jīng)高壓蒸汽滅菌置無(wú)菌器皿中備用，0.5ml無(wú)菌帶蓋塑料離心管。將待保存菌種在血平板上分離純化后，用無(wú)菌小鑷子夾住濾紙片，在平板上刮取多量細(xì)菌，放在塑料離心管內(nèi)，1只離心管中可放數(shù)十片帶菌濾紙片，然后蓋上蓋子，用膠布將蓋口封嚴(yán)，注明患者姓名，菌名及保存日期等以備查找。將塑料管放在-70℃冰箱內(nèi)保存。使用時(shí)將菌種分別從塑料離心管中取出1片，放入增菌肉湯中,35℃孵育18～24ｈ，再將菌懸液移種于血平板上。本方法適于保存對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高的細(xì)菌，而不適于苛養(yǎng)菌的保存。
七、濕牛奶冷凍法
材料 ①保護(hù)劑牛奶的準(zhǔn)備：新鮮牛奶經(jīng)脫脂棉反復(fù) 3次過(guò)濾后，10磅10min高壓蒸氣滅菌后，冰箱保存?zhèn)溆?。②菌種管的處理：先經(jīng)清潔液浸泡1天，之后用清水沖洗，再用蒸餾水浸泡過(guò)夜，以達(dá)中性，然后管口塞上棉花，經(jīng)15磅30min高壓蒸氣滅菌備用。
方法 將各種細(xì)菌種于各自生長(zhǎng)良好的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)分純后在37℃孵箱孵育18h后，用準(zhǔn)備好的保護(hù)劑牛奶洗下菌苔，然后用無(wú)菌毛細(xì)滴管吸取菌懸液滴入菌種管球部，每管球部約有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃冰箱。抵抗強(qiáng)的細(xì)菌至少可保存3年，抵抗力弱的細(xì)菌保存不低2年。
八、細(xì)菌鑒定卡保存菌種
本法適用于使用VITEK全自動(dòng)微生鑒定儀的實(shí)驗(yàn)室。方法是將鑒定卡標(biāo)注后直接放置-20℃冰箱保存，復(fù)蘇時(shí)將鑒定卡直接從-20℃移至35℃，待小孔液體融化后，以無(wú)菌手續(xù)，用注射器抽吸出陽(yáng)性生長(zhǎng)孔內(nèi)的液體，點(diǎn)種于合適平板，置35℃孵箱內(nèi)24～48小時(shí)即可。該法生化卡內(nèi)的細(xì)菌反復(fù)凍融 5次，分離出的細(xì)菌效果相同。葡萄球菌屬、腸桿菌屬、念珠菌屬存活時(shí)間不小于29個(gè)月；腸球菌屬、黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬存活時(shí)間不小于21個(gè)月,鏈球菌屬和假單胞菌屬存活時(shí)間不小于10個(gè)月。
九、商品化菌種保存管
每只保藏管中含20-25個(gè)小珠以及緩沖液，使用時(shí)將菌落挑入緩沖液中，混勻，將緩沖液吸去，置-70℃冰箱保存可達(dá)10年，-20℃冰箱可保存1-3年。復(fù)蘇時(shí)，只需將小珠接入肉湯或平板上滾動(dòng)即可。商品化菌種保存管操作簡(jiǎn)單，但價(jià)格偏高。筆者預(yù)計(jì)隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和實(shí)驗(yàn)室條件的改善，使用的單位將會(huì)越來(lái)越多。
十、冷凍真空干燥保存法
該法是目前保存菌種的最佳方法，具有如下幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)：①適用范圍廣。除少數(shù)不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用此方法保藏外，其他各大類微生物如細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期長(zhǎng)，成活率高。有人報(bào)道保藏在真空冷凍干燥安培管中的真菌成活期長(zhǎng)達(dá)40多年，一般微生物至少可保存10余年；③微生物在保藏期內(nèi)可避免其它雜菌污染；④便于攜帶運(yùn)輸，易實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。其缺點(diǎn)為需要一定的設(shè)備（冷凍真空干燥機(jī)）、操作繁瑣等。菌種管由傳統(tǒng)的玻璃菌種管改為0.5ml帶蓋塑料離心管。方法：①將塑料離心管置耐高壓塑料離心管盒內(nèi)并用雙層報(bào)紙包好，高壓蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在凈化工作臺(tái)內(nèi)將脫脂牛奶洗下的濃厚菌懸液用長(zhǎng)毛細(xì)玻璃滴管加到塑料離心管的底部，每只0.2ml左右，切記不要將牛奶污染離心管口。③將加好菌液的離心管盒置-20℃冰箱預(yù)凍，預(yù)凍好后把離心管盒放置到冷凍干燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干。④凍干后在凈化工作臺(tái)內(nèi)壓好離心管蓋，不抽真空。貼標(biāo)簽，用封口膜封離心管口。放-20℃冰箱保存。
臨床微生物實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)本室的條件，挑選的菌種保存法，也可以加以改良，其原則是除了菌種存活外，還必須保證其生物學(xué)性狀不發(fā)生改變。
