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傳代細(xì)胞 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

2013年09月17日 14:36通派（上海）生物科技有限公司點(diǎn)擊量：1295

  傳代細(xì)胞  細(xì)胞凋亡檢測(cè)

 

細(xì)胞凋亡檢測(cè)

 

根據(jù)調(diào)亡的生化特征的檢測(cè)方法

一、瓊脂 糖凝膠電泳

1）常規(guī)的瓊脂 糖凝膠電泳

方法一：

1．收集細(xì)胞（5×106）1000r/min，離心5min，去上清。

2．PBS 洗一次，1000r/min，離心5min，去上清。

3．加細(xì)胞核 裂解液500μl重懸細(xì)胞，50℃水浴，3～5h，不時(shí)振搖或37℃過夜。

4．加0.5ml平衡酚抽提，上下顛倒幾次混勻，6000r/min，離心5min。

5．上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：異戊醇抽提，上下顛倒幾次混勻，6000r/min，離心5min。

6．上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸鈉和2ml預(yù)冷無水乙醇，上下顛倒幾次混勻，可見絮狀白色沉淀物。

7．置液氮5～10min，12 000r/min離心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或風(fēng)扇下吹干殘存液體。

8．加50～100μl TE緩沖液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。

9．取20μl加上樣緩沖液2～5μl，1％瓊脂 糖凝膠電泳（電壓50V，1.5～2h），UV下觀察。

  傳代細(xì)胞  細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法二：

1．離心收集細(xì)胞（5×106），PBS（無Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。

2．0.5ml TBE溶液重懸，37℃孵育30min。

3．1mg/ml蛋白酶K 37℃處理30min。

4．加入上樣緩沖液0.1ml。

5．25μl上樣，1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳，2V/cm 6h。

 

  傳代細(xì)胞  細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法三：

1．收集細(xì)胞懸液（106細(xì)胞），低速離心（1000r/min，離心5min）。

2．去上清，沉淀加0.4ml低滲緩沖液作用1h。

3．13 000r/min，離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，加等量50％異丙醇和0.5mol/L NaCl混勻，置液氮5min。

4．12 000r/min，離心10min，棄上清，沉淀真空抽干。

5．加TE 100μl，65℃加熱10min，取20μl，加1～2μl上樣緩沖液，電泳觀察。

 

方法四：

1．收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，去上清。

2．用冰預(yù)冷的70％乙醇固定，可長(zhǎng)期保存于－20℃冰箱。

3．1000r/min離心5min，去除固定液，用約0.5ml的PBS重懸細(xì)胞。

4．轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，同法離心，去上清。

5．細(xì)胞用40μl PC緩沖液重懸，室溫30～60min。

6．1000r/min離心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空濃縮15min。

7．加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。

8．加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。

9．加入12μl樣品稀釋液，含溴化乙錠的1.5％瓊脂糖電泳，觀察。

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