人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞  凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞  凍存與復(fù)蘇

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5  
人胚肺成纖維細(xì)胞CCC-HPF-1  
人胚胎氣管組織來源細(xì)胞CCC-HBE-2  
人胚胎肺成纖維細(xì)胞WI-38  
SV-40Z轉(zhuǎn)化肺成纖維細(xì)胞WI38/VA13  
人胚肺二倍體細(xì)胞2BS  
人胚肺二倍體細(xì)胞KMB-17  
人肺細(xì)胞HLF-a  
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS 153  
人胚肺細(xì)胞 VA13細(xì)胞WI-38 VA13亞系 2RA  
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-1  
人胚肺細(xì)胞系KuMA  
人肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞系A(chǔ)E1201    
人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H226  
人胚肺二倍體細(xì)胞HEL-2  
人支氣管上皮樣細(xì)胞BEAS-2B  
人胚肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞SL-1  
人肺腺癌細(xì)胞Calu-3  
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H209  
人低分化肺腺癌細(xì)胞GLC-82  
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H446  
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H157  
人肺鱗癌細(xì)胞NCI-H520  

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞  凍存與復(fù)蘇
人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)G-BE1  
人肺巨細(xì)胞癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株P(guān)G-LH7  
人肺癌細(xì)胞A-427  
人低分化肺腺癌細(xì)胞SK-LU-1  
人肺支氣管癌細(xì)胞NCI-H1650  
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H1975  
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H2087  
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H2227  
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H23  
人肺腺鱗癌細(xì)胞NCI-H596  

◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基，
◆50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
◆50% 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50% 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
1.懸浮細(xì)胞
●計數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2.貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。