理，許多學(xué)者充分發(fā)揮創(chuàng)造性思維，對(duì)PCR技術(shù)進(jìn)行研究和改進(jìn)，使PCR技術(shù)得到了進(jìn)上步地完善，并在此基礎(chǔ)上派生出了許多新的用途.

1、原位PCR技術(shù)

原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行pcr反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項(xiàng)有較大潛力的新技術(shù).

原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實(shí)驗(yàn)用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等.其基本方法為①固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶.②蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K.③PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增.有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置.④雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交.⑤顯微鏡觀察結(jié)果.

原位PCR既能分辯鑒定帶有靶序列的細(xì)胞，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實(shí)用價(jià)值.其特異性和敏感性高于一般的PCR.

2、連接酶鏈反應(yīng)

連接酶鏈反應(yīng)(Ligase chain reaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增.

連接酶鏈反應(yīng)是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)發(fā)明，并申報(bào)了.1988年Landegren也進(jìn)行了該項(xiàng)研究.1988年Backman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，而申報(bào)，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進(jìn)行了LCR試驗(yàn).耐熱DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序.

LCR的基本原理為利用DNA連接酶.特異地將雙鏈DN***段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)，從而使靶基因序列大量擴(kuò)增.其程序?yàn)?在模DNA、DNA連接酶、寡核苷酸引物以及相應(yīng)的反應(yīng)條件下，首先加熱至一定溫度下(94～95℃)使DNA變性，雙鏈打開，然后降溫退火(65℃)，引物與之互補(bǔ)的模板DNA結(jié)合并留下一缺口，如果與靶序列雜交的相鄰的寡核苷酸引物與靶序列*互補(bǔ)，DNA連接酶即可連接封閉這一缺口，則LCR反應(yīng)的三步驟(變性-退火-連接)就能反復(fù)進(jìn)行，每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中作模板，使更多的寡核苷酸被連接與擴(kuò)增.若連接處的靶序列有點(diǎn)突變，引物不能與靶序列結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，也就不能形成連接產(chǎn)物.

LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長度為20～26個(gè)，以保證引物與靶序列的特異性結(jié)合，LCR識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性.LCR連接反應(yīng)溫度接近寡苷酸的解鏈溫度(Tm)，因而識(shí)別單核苷酸錯(cuò)配的特異性*.

LCR的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)，用耐熱連接酶做LCR只用兩個(gè)溫度循環(huán)，94℃min變性和65℃復(fù)性并連接，循環(huán)30次左右.其產(chǎn)物的檢測(cè)也較方便靈敏.目前該方法主要用點(diǎn)突變的研究與檢測(cè)、微生物病原體的檢測(cè)及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多態(tài)性及單堿基遺傳病的產(chǎn)物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點(diǎn)突變研究等.

3、依賴核酸序列的擴(kuò)增

依賴核酸序列的擴(kuò)增(Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，又稱自主序列復(fù)制系統(tǒng)(self-sustainedsequence replication，3SR)或再生長序列復(fù)制技術(shù).1990年Guali等首先報(bào)道了這一技術(shù).NASBA主要用于RNA的擴(kuò)增、檢測(cè)及測(cè)序.該反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協(xié)作而完成.

NASBA反應(yīng)體系中除含有上述三種酶外，還含有dNTP，NTP(核糖核苷)，

兩種特殊的引物和緩沖液.引物I3'末端與靶序列互補(bǔ)，5'端含T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子，這一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的堿基序列與cDNA的5'未端互補(bǔ).

在NASBA反應(yīng)時(shí)，首先引物Ⅰ與RNA模板復(fù)性(結(jié)合)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，RNaseH水解cDNA上的RNA，形成一條單鏈的DNA;引物Ⅱ隨即與此cDNA的5'未端結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶在此DNA模板的指導(dǎo)下合成第二條DNA鏈.這樣形成的DNA雙鏈含有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子.該酶即以此DNA為模板，轉(zhuǎn)錄出與樣品RNA序列相同的RNA鏈，而且每條DNA模板在該酶的作用下可合成約100個(gè)拷貝的RNA.每條新的RNA又可作為逆錄酶的模板合成cDNA.如此反復(fù)進(jìn)行，將獲得更多的RNA和cDNA.

其基本方法為:將引物，標(biāo)本加入擴(kuò)增反應(yīng)液，65℃1min使RNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)打開，降溫至37℃加入逆轉(zhuǎn)錄酶，T7RNA聚合酶和RNaseH，并在37℃反應(yīng)1～1.5小時(shí)，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶.NASBA的特點(diǎn)為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán).整個(gè)反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實(shí)性高，其擴(kuò)增效率高于PCR，特異性好.

4、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)

轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增系統(tǒng)(Transcript-based amplification system，TAS)，是Kwen等人于1989年研究報(bào)道的，主要用于擴(kuò)增RNA.

合成A、B引物，引物A的3'末端與待擴(kuò)增RNA互補(bǔ)，其5'端有T7RNA多聚酶的啟動(dòng)子信息.逆轉(zhuǎn)錄酶以A引物為起點(diǎn)合成cDNA;引物B與此cDNA3'端互補(bǔ)合成cDNA第二鏈.逆轉(zhuǎn)錄酶除具有逆轉(zhuǎn)錄活性外，還有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此雙鏈DNA為模板.轉(zhuǎn)錄出與待擴(kuò)增RNA一樣的RNA，這些RNA又可作為下輪反應(yīng)的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高，一個(gè)模板可轉(zhuǎn)錄10～103個(gè)RNA拷貝，因而反應(yīng)液中待檢RNA的數(shù)量以10的指數(shù)方式擴(kuò)增.

TAS的主要特點(diǎn)是擴(kuò)增效率高，因?yàn)槠銻NA拷貝數(shù)呈10的指數(shù)方式增加，只需6個(gè)循環(huán)靶序列的拷貝數(shù)就能達(dá)到2×106.它的另一個(gè)特點(diǎn)是特異性高，由于TAS只能進(jìn)行6次溫度循環(huán)，錯(cuò)摻率低，加之用葡聚糖珠夾心雜交，因而特異性也高.雖然本法有較高的特異性和敏感性，但其循環(huán)過程復(fù)雜，需重復(fù)加入逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶，有待進(jìn)一步研究.

5、Qβ復(fù)制酶反應(yīng)

Kacian等于1972年報(bào)報(bào)Qβ復(fù)制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我復(fù)制功能，它能在常溫30min，將其天然模模MDV-1RNA擴(kuò)增至109.1986年Chu等報(bào)道用生物標(biāo)記的靶序列特異性探針，可與親和素聯(lián)接的MDV-1RNA雜交，經(jīng)洗脫未被結(jié)合的MDV-1后，再加入Qβ復(fù)制酶，擴(kuò)增復(fù)制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測(cè)或用同源性的第二探針雜交.

Qβ復(fù)制酶是一種RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶，它有3個(gè)特點(diǎn):①不需寡核苷酸引物的引導(dǎo)就可啟動(dòng)RNA的合成.②能特異地識(shí)別RNA基因中由于分子內(nèi)堿基配對(duì)而形成的*的RNA折疊結(jié)構(gòu).③在Qβ復(fù)制酶的天然模板MDV-1RNA的非折疊結(jié)構(gòu)區(qū)插入一短的核酸序列不影響該酶的復(fù)制.因而，如在此區(qū)插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增.

1988年Lizardi等，將靶基因序列插進(jìn)MDV-1質(zhì)粒里，用T7RNA聚合酶催化轉(zhuǎn)錄出MDV-1RNA探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然后洗去非雜交的探針，加入Qβ復(fù)制酶來擴(kuò)增探針，被擴(kuò)增的探針又可作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并呈指數(shù)遞增.其產(chǎn)物按上述兩種方法進(jìn)行檢測(cè).現(xiàn)在該技術(shù)又發(fā)展了夾心雜交法，分子開關(guān)和靶依賴的復(fù)制等技術(shù).

6、標(biāo)記PCR和彩色PCR

標(biāo)記PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利同位素或熒光素對(duì)PCR引物的5'端進(jìn)行標(biāo)記，用來檢測(cè)靶基因是否存在.彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一種.它用不同顏色的熒光染料;標(biāo)記引物的5'端，因而擴(kuò)增后的靶基因序列分別帶有引物5'的染料，通過電泳或離心沉淀，肉眼就可根據(jù)不同熒光的顏色判定靶序列是否存在及其擴(kuò)增狀況，此法可用來檢測(cè)基因的突變，染色體重排或轉(zhuǎn)位，基因缺失及微生物的型別鑒定等.

7、反向PCR

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DN***段.實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對(duì)該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對(duì)反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對(duì)未知序進(jìn)行分析研究.

8、不對(duì)稱PCR

不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA).這對(duì)引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應(yīng)的zui初10～15個(gè)循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物(低濃度引物)消耗完后，非限制性引物(高濃度引物)引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA.不對(duì)稱PCR的關(guān)鍵是控制限制性引物的量，需多次摸索優(yōu)化兩條引物的比例.還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴(kuò)增，制備雙鍵DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進(jìn)行第二次PCR，制備ssDNA.不對(duì)稱PCR制備的ssDNA，主要用于核酸序列測(cè)定.

9、重組PCR

使兩個(gè)不相鄰的DN***段重組在一起的PCR稱為重組PCR(recombinant PCR).Mullis等于1986年報(bào)道了由PCR擴(kuò)增的兩個(gè)DN***段通過重組合后再經(jīng)延伸而制備出新的DNA分子.其基本原理為將突變堿基，插入或缺失片段，或一種物質(zhì)的幾個(gè)基因片段均設(shè)計(jì)在引物中，先分段對(duì)模板擴(kuò)增，除去多余的引物后，將產(chǎn)物混合，再用一對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增.其產(chǎn)物將是一重組合的DNA.重組PCR主要用于位點(diǎn)專一堿基置換，DN***段的插入或缺失DN***段的連接(如基因工程抗體).

10、多重PCR

一般PCR僅應(yīng)用一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定.多重PCR(multiplex PCR)，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理，反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同.

11、多重PCR的用途主要有兩方面:

1.多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定，它是在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染，，可系統(tǒng)組合的有:①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內(nèi)，有時(shí)存在多種肝炎病毒重疊感染，有時(shí)是甲乙丙型肝炎病毒重疊;有時(shí)可能是甲乙型肝炎病毒重疊;有時(shí)是乙丙型肝炎病毒重疊.②腸道致病性細(xì)菌的檢測(cè)，如傷寒，痢疾和霍亂，有時(shí)具有較相同的腸道癥狀，有時(shí)痢疾霍亂同存一病人并同時(shí)發(fā)病.③性病的檢測(cè)，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷.④戰(zhàn)傷細(xì)菌及生物戰(zhàn)劑細(xì)菌的檢測(cè)，如破傷風(fēng)桿菌，產(chǎn)氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢.⑤需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等.

2，病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定:某些病原微生物，某些遺傳病或癌基因，型別較多，或突變或缺失存在多個(gè)好發(fā)部位，多重PCR可提高其檢出率并同時(shí)鑒定其型別及突變等可系統(tǒng)應(yīng)用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳頭瘤病毒的分型;單純皰疹病毒的分型;杜氏肌營養(yǎng)不良癥的分型及癌基因的檢測(cè)等.

多重PCR的特點(diǎn)有:①性，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，特別是用一滴血就可檢測(cè)多種病原體.②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測(cè)，如肝炎病毒，腸道致病性細(xì)菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細(xì)菌及細(xì)菌戰(zhàn)劑的同時(shí)偵檢.③經(jīng)濟(jì)簡便性，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢出，將大大的節(jié)省時(shí)間，節(jié)省試劑，節(jié)約經(jīng)費(fèi)開支，為臨床提供更多更準(zhǔn)確的診斷信息.

12、免疫-PCR

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測(cè)系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性和PCR擴(kuò)增反應(yīng)的*靈敏性來檢測(cè)抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測(cè).

免疫-PCR試驗(yàn)的主要步驟有三個(gè):①抗原-抗體反應(yīng)，②與嵌合連接分子結(jié)合，③PCR擴(kuò)增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)與抗原抗體復(fù)合物中的抗體結(jié)合，一個(gè)與質(zhì)粒DNA結(jié)合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標(biāo)記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應(yīng)中形成抗原抗體-連接分子-DNA復(fù)合物，通過PCR擴(kuò)增DNA來判斷是否存在特異性抗原.

免疫PCR優(yōu)點(diǎn)為:①特異性較強(qiáng)，因?yàn)樗⒃诳乖贵w特異性反應(yīng)的基礎(chǔ)上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴(kuò)增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個(gè)抗原的檢測(cè).③操作簡便，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒DNA比擴(kuò)增靶基因容易得多，一般實(shí)驗(yàn)室均能進(jìn)行.