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按照RNA分離操作方案在*移去水樣層后,勻漿中的DNA存在于中間層和苯酚層中也可以被分離出來。在沉淀和多次洗脫后,DNA溶解在8 mM NaOH中。用TRIZOL試劑從組織和培養細胞中*回收的DNA可以用來做樣品中DNA含量的測定。同時抽提的基因組DNA可以用于對Northern analysis的結果進行標準化,因為基因組DNA變異程度比總RNA或組織重量要小。[由于來源的不同,所得到的DNA沉淀在進一步應用前可能需要額外的純化步驟(例如苯酚抽提等等)。]
實驗所需但試劑未提供的物品:
* 酒精
* 0.1 M檸檬酸鈉(用10%酒精配制)
* 75%酒精
8 mM NaOH
如無例外,以下操作均應在15—30℃下完成。
1.DNA的沉淀
移除中間層上殘余的水樣層,用酒精從中間層和苯酚層中沉淀DNA。按zui初勻漿化時每1 ml TRIZOL加0.3 ml的無水乙醇,反復顛倒來混合樣品。然后將樣品置于15—30℃下2—3分鐘,再在2—8℃下以不超過2,000×g的離心力離心5分鐘沉淀DNA。
小心移除水樣層對抽提的DNA的質量至關重要。
2. DNA的洗脫
移除離心后苯酚層中的上清液,如有必要,可以將其保留用于抽提蛋白。用0.1 M檸檬酸鈉(用10%酒精配制)洗滌DNA沉淀兩次。按zui初勻漿化時每1 ml TRIZOL加1 ml檸檬酸鈉溶液。每次洗滌時洗滌液要和DNA沉淀在15—30℃下作用30分鐘(期間周期性混勻)再在2—8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。在兩次洗滌完成后,用75%的酒精重懸DNA沉淀(每1 ml TRIZOL加1.5—2 ml75%酒精),在15—30℃下放置10—20分鐘(期間周期性混勻)然后再在2—8℃下以2,000×g的離心力離心5分鐘。
對于較大的DNA沉淀(> 200 μg)或樣品中含有較多的非DNA物質需要用0.1 M檸檬酸鈉(用10%酒精配制)溶液再洗滌一次。
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