堿裂解法從大腸桿菌制備質粒，是從事分子生物學研究的實驗室每天都要用的常規技術。可以我收研究生十幾年了，幾乎毫無例外的是我那些給人感覺什么都知道的學生卻對堿法質粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因為《分子克隆》里面只講實驗操作步驟，而沒有對原理進行詳細的論述。這是導致我的學生誤入歧途的主要原因。后來我發現其實是整個中國的相關領域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老師”也是這個狀態。這就不得不讓人感到悲哀了。我想這恐怕和我們的文化有點關系。中國人崇尚讀書，“學而優則仕”的觀念深入人心。經常聽到的是父母對他們的獨苗說，你只要專心讀好書就可以了。所以這讀書的定義就是將教課書上的東西記住，考試的時候能拿高分……這就是現代科學沒有在中國萌發的根本原因。如果中國文化在這一點上不發生變化，那么科學是不能在中國真正扎根的，它只能蛻化成新的“八股學”。生命科學是實驗科學，它講究動手。如果實驗科學只要看看書就可以了，那我想問有那位*看看書就會騎自行車了？或者聽聽體育老師的講解就會滑冰了？可是光動手不思考，不就成了一個工匠？一個合格的生命科學研究者，需要在這兩方面完善自己。一個杰出的科學工作者，是一個熟知科學原理并善于應用的“藝術家”。每個曾經用堿法抽提過質粒的同學，希望你看本文后能有所思考，讓中國的未來有希望。

為了方便理解，這里羅列一下堿法質粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后zui大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，
幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為zui終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或lb培養基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊.輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。

事實上NaOH是的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：

*，時間不能過長，千萬不要這時候去接，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；

第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細說明。

每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質。zui容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性后發生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發生的沉淀，那會不會是遇鹽發生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發現SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發現沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。