該試劑盒用于從克隆菌中大量提取去除內毒素的高品質質粒，一般來說可從200ml過夜培養的菌液中提取高拷貝質粒600-1200ug，低拷貝質粒50-400ug。試劑盒自帶的說明書為英文說明書，不是非常方便閱讀，所以本文根據英文原版重新翻譯了一遍，希望對大家有幫助。

實驗前準備
1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。
試劑盒型號    加入的乙醇量（ml）
D6926-00B    60
D6926-01B    160
D6926-03B    200
D6926-04B    200每瓶

細菌的培養：
1. 在容積為1-4升的培養瓶中加入200ml含篩選抗生素的LB培養基，加入含目的質粒的克隆菌（一般為1/1000比例接種，也即200ul），然后置37℃振蕩培養12-16小時。為了獲得*的效果，推薦接菌使用經過夜培養活化的菌種。對于大多數質粒的提取，我們強烈推薦使用endA陰性的菌種，比如DH5α和JM109。
*的培養條件對于質粒DNA的得率至關重要。*的培養條件包括，首先由新轉化或新劃線的培養板中挑取單個克隆，然后接種于2-5ml含合適篩選抗生素的培養基中，37℃振蕩（搖床轉速設定在約300rpm為宜）培養約8小時；然后繼續接種于含抗生素的預熱的液體培養基中，37℃振蕩（~300rpm）培養12-16小時。盛培養基的容器的容積需至少為培養基體積的3-4倍（注：保證培養環境中有足夠的氧氣，防止厭氧菌的繁殖），初始培養基接種的稀釋比例為1/500到1/1000為宜。

為了獲得*的效果，我們推薦每次培養后測定OD600值。對于過夜培養活化的細菌而言，OD600的值處于1.5-2.0之間是細菌生長良好的指標。在測定OD600時，為了保證測量值處于光度計測量的線性范圍（0.1-0.5），需將培養物進行必要的稀釋（10到20倍）。當接種進行大量培養時，我們推薦細菌的終密度在2.0-3.0之間為宜。當使用富營養的培養基，需要注意保證細菌的密度不要超過OD600為3.0；如果使用凍存的甘油菌，需要首先進行劃線并挑取單克隆，然后和前面一樣進行必要的活化。

富營養培養基如2xYT或TB，不推薦使用本試劑盒。

堿性-SDS溶液裂解細菌：
2. 取100-200ml菌液3,500-5,000xg室溫離心10min收集菌體沉淀。
3. 小心去除上清液，為了保證所有上清去除*，可使用干凈的紙巾將容器壁上液滴吸除，加10ml Solution Ⅰ/RNase A , 渦旋或用移液槍上下吹打重懸菌體，重懸*對于獲得zui高的得率至關重要;
4. 加10ml SolutionⅡ，來回顛倒10-15次輕柔混勻，以得到澄清的裂解液。如有必要可室溫孵育2min。
避免混合時動作過于劇烈，過于劇烈會剪切細菌的染色體DNA（從而在接下來的步驟中不能被充分沉淀）并且導致質粒的純度降低。（當Solution II在不使用時，需要將瓶蓋旋緊，防止空氣中的CO2與Solution II反應生成碳酸鹽）
5. 加5ml Buffer N3，輕輕顛倒充分混勻幾次直至白色絮狀沉淀出現。室溫放置2—3min，期間偶爾顛倒混合，以使其充分反應。
注意：該溶液必須充分混合。如果混合物依然非常的粘滯，呈褐色并且成團狀，則需要進一步混合以充分中和該溶液，充分中和對于獲得更好的得率至關重要。使用冰預冷的Buffer N3將有利于沉淀更多的細菌蛋白。
6. 準備結合柱：加5ml的Buffer GPS至結合柱中，室溫放置3—10min，3,000—5,000×g室溫離心5min，棄濾液（注：這里中文說明書中添加了一步“往柱子里加入10ml無菌水離心棄濾液”，而在英文原版中是沒有的），把柱子插回50ml收集管中。（注：這里可以使用一個舊的50ml離心管收集廢液，而將試劑盒中附帶的新離心管用于zui后一步質粒洗脫時使用）。

使用針筒式過濾器過濾裂解物：
7. 將第5步得到的裂解液及沉淀物全部轉移至針筒式過濾器中，準備一個干凈的50ml離心管收集濾液。將過濾器的活塞插回針筒。
8. 將針筒對準50ml收集管，輕輕推動活塞，收集澄清的濾液。一些裂解液中可能仍然殘留有絮狀沉淀物，不要強行將這些殘留的裂解液推擠過柱。
9. 加入等體積的ETR Binding Buffer（~25ml）到結合柱上，上下反復顛倒7-10次。

使用HiBind結合柱純化質粒DNA（注：離心法，適用于同時抽提多個樣品，對于樣本量較少時，推薦使用后面的真空抽濾法）
10. 小心轉移裂解液至HiBind結合柱，3,000—5,000×g離心3—5min,使液體濾過柱子，棄濾液。
11. 重復步驟10，直至所有裂解液都過濾完，棄濾液。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min,使全部液體濾過柱子，棄濾液。
13. 加入10ml Buffer EHB到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer（預先添加了乙醇）到結合柱上，3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
注意：試劑盒附帶的DNA Wash Buffer在使用之前必須按標簽的提示用無水乙醇稀釋。如果試劑是低溫保存的，使用前需要預先恢復溫度至室溫。
15. 加入10ml DNA Wash Buffer到結合柱上3,000—5,000×g離心3—5min使全部液體濾過柱子，棄濾液；
16. 把空柱子套回離心管，zui大轉速（不超過6,000×g）離心10—15min使柱子充分干燥。不要跳過該步驟-該步對于去除柱子中殘留的乙醇非常關鍵。

使用HiBind結合柱純化質粒DNA（注：真空抽濾法，對于樣品個數較少時，該方法比較節省時間）
10. 安裝好抽濾裝置，將結合柱與抽濾瓶密閉結合
11. 轉移裂解液至HiBind結合柱，使液體全部濾過柱子。
12. 加入10ml ETR Wash Buffer到結合柱上，洗滌一次（注：流速可能會比較慢）。
13. 加入10ml Buffer EHB到結合柱上，洗滌一次。
14. 加入15ml DNA Wash Buffer（預先添加了乙醇）到結合柱上，洗滌一次。
15. 再次加入10ml DNA Wash Buffer，洗滌一次。
16. 繼續抽真空10-15min，以充分干燥結合柱（注：當抽提多個樣品時，可以選擇離心法步驟16中的方法以節約時間）。

由結合柱洗脫質粒DNA（常規方法，也可以使用后面介紹的另一種洗脫方法）
17. 進一步干燥柱子：選擇以下任一種方法在洗脫前進一步干燥結合柱
    A. 將結合柱轉移真空抽濾裝置上室溫抽濾15min
    B. 將結合柱放入65℃恒溫烤箱，烘烤10—15min
18. 把結合柱套在一個新的50ml離心管中（注：可以使用試劑盒附帶的離心管），加入1—3ml（注：依據要求的質粒終濃度，可以分步兩次洗脫，第一次少量洗脫保證得到高濃度的質粒，第二次稍加大洗脫體積，保證盡可能將質粒洗脫*） Endotoxin-Free Elution Buffer（或去離子水）至結合柱的膜上，室溫放置2—5min，以zui高轉速離心（不超過6,000xg）5min洗脫質粒DNA。

上面描述的方法可以回收大約60-80%柱結合的DNA。也可以選擇進行二次洗脫從而將所有殘留的DNA全部回收，但二次洗脫的DNA濃度會低一些。另外，第二次洗脫也可以使用*洗脫下來的液體以保證得到較高濃度的質粒DNA。將洗脫液或去離子水預熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。

注意：使用該方法得到的質粒可以很好的應用與PCR，限制性酶切，脂質體轉染等。預期的質粒濃度可能依據質粒的拷貝數不同存在一些出入。但是，一般來說高拷貝的質粒終濃度在150-600ug/ml。該方法得到的質粒可能會包含一些乙醇殘留，但一般不會影響下游實驗。如果需要獲得更高的質粒濃度和*去除乙醇殘留，可以選擇使用下面的方法。

另一種結合柱洗脫質粒DNA的方法

1. 把結合柱套在一個新的50ml離心管中（注：可以使用試劑盒附帶的離心管），加入6ml Endotoxin-Free Elution Buffer（或去離子水）至結合柱的膜上，室溫放置2min，以zui高轉速離心（不超過6,000xg）5min以洗脫質粒DNA。將洗脫液或去離子水預熱至70℃并且在洗脫前，室溫放置2min，可能會顯著提升zui終的得率。

2. 將洗脫的質粒DNA轉移到一個干凈的適用于沉淀的離心管中。加入260ul 5M NaCl以及4.4ml室溫放置的異丙醇。渦旋以充分混勻，然后以不低于15,000×g轉速4℃離心30min。小心地去除上清。

3. 用2ml 70%的乙醇洗滌沉淀一次，以不低于15,000×g轉速4℃離心10min，小心地去除上清。空氣干燥沉淀5-10min。

4. 加入200-500ul（依據要求的質粒終濃度）Endotoxin-Free Eluiton Buffer或去離子水重懸DNA。