羥脯a氨酸（HYP）測試盒 可見分光光度法 正式測定務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
規格：100管/48樣，100管/96樣 ;  50管/24樣，50管/48樣
測定方法：可見分光光度法，微量法

需自備的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制
試劑一：液體100mL×1瓶，-20℃保存；
試劑二：液體20mL×1瓶，-20℃保存；
試劑三：液體1.5mL×1瓶，-20℃保存；
試劑四：液體25mL×1瓶，-20℃保存；
試劑五：液體1mL×1支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，用時加入2mL蒸餾水；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
工作液的配制：臨用將試劑五轉移到試劑四中混合溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本的處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準確稱取0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅰ（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10，重復30次），用于復合體Ⅰ酶活性測定。

測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 樣本測定

（1）工作液于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、200μL工作液和15μL試劑六，混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
復合體Ⅰ活力單位的計算
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=365×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.73×ΔA
V反總：反應體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。
b.使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3616×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2） 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
 復合體Ⅰ活力（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=730×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅰ活力（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.46×ΔA
V反總：反應體系總體積，2.25×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500萬。


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