傳代細胞 培養問題

支原體(mycoplasma) 污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？      
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。 

怎樣查到一個特定細胞株的相關知識和培養條件？      
ATCC (American Type Culture Collection) 收集了絕大多數細胞的詳細資料。打開ATCC網頁的Cells and hybridomas鏈接，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞數據庫。數據庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養和凍存條件，以及相關文獻等資料。

為什么要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?     
胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘就會變得不穩定 。

為什么培養的細胞要及時傳代？      
體外培養的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代后，細胞的生長得以繼續。 

培養液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什么？      
通常細胞生長得非常快時，pH值通常下降得很快。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進行解決。此外，培養瓶蓋擰得太緊、NaHCO3 緩沖系統緩沖能力不夠、培養液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌污染等也能導致pH值通常下降得很快。         
(1)按培養液中NaHCO3 濃度增加或減少培養箱內CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。        
(2)改用不依賴CO2培養液。         
(3)松開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩沖液至10 到25mM終濃度。         
(4)在CO2 培養環境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks 鹽配制的培養液。         
(5)如果是污染造成的則丟棄培養物或用抗生素除菌。

培養液pH對細胞生長的影響？      
由于大多數細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養用液時，需要注意一點：培新配的培養基在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。 

購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？      
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。但對于DMSO敏感的細胞，還是復蘇細胞時，用離心去除DMSO比較好。

購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？      
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，原因比較復雜，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；細胞置于–80 ℃太久等。建議嚴格參照ATCC或ECACC的標準操作規程進行細胞復蘇、凍存等工作。

支原體污染會對細胞培養有何影響？      
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數、代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

冷凍保存細胞之方法？      
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃(30－60 分鐘)→-20℃( 30 分鐘) → -80℃(16－18 小時或隔夜)→ 液氮罐長期儲存。  冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中長期儲存。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

懸浮細胞應如何繼代處理？      
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養瓶中，稀釋細胞濃度即可。若培養液太多時可分瓶取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養瓶中，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？      
欲回收動物細胞，其離心速率一般為300×g (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉速過長時間都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據相對離心決定。 RCF=1.119×105×r×(rpm)2，其中 r為離心機轉軸中心與離心套管底部內壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉數；RCF(relative eentrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數來表示表示單位。  

培養細胞時應使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？      
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7g時，細胞培養時應使用10% CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養細胞。

細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？      
除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞)，在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養方瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。 

冷凍管應如何解凍？     
取出冷凍管后，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超凈工作臺操作細胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養基將細胞轉移至培養瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

如何用臺盼蘭計數活細胞？      
將樣品適當稀釋后，用稀釋后的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合后，用移液槍點樣到血球計數板，置于倒置顯微鏡下觀察、計數，其中藍色細胞是死細胞，因活細胞排斥臺盼蘭，不被染色。  

細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？     
冷凍管內細胞數目一般為1-8×106 cells/ml vial。 

細胞冷凍培養基之成份為何？     
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

如何消除組織培養的污染？      
當重要的培養細胞污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。    高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。  
1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。  
2)分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 
3)每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。  
4)確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。
5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 
6)重復步驟4。  
7)在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定污染是否以已被消除。

培養細胞出現死亡其可能的原因有什么？解決辦法有哪些？      
可能的原因有培養箱內無CO2；培養箱內溫度波動太大；細胞凍存或復蘇過程中損傷；培養液滲透壓不正確；培養液種有毒代謝產物堆積等。解決辦法可以檢測培養箱內CO2濃度，檢查培養箱內溫度；取新的保存細胞種；檢測培養液滲透壓等；換入新鮮培養液等。 

細胞的滲透壓耐受性是多少？      
細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg, 可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜