現代病毒研究往往需要大量的純病毒粒子,以便于化學研究或制備抗體。在這里我們簡明地描述一下脊髓灰質炎病毒(Polio virus)的純化步驟。它是一種已被廣泛研究的危害人體健康的病毒。
通過沉淀將病毒物質濃縮。由于病毒是蛋白質性質的,它們能通過蛋白質沉淀法沉淀。脊髓灰質炎病毒可通過高濃度的NH4Cl(每毫升培養液中加0.4g)沉淀下來。這一過程要在低溫下進行,NH4Cl要在攪拌下緩慢加到培養液中。由于病毒蛋白沉降,溶液將變得渾濁。
將沉淀物通過低速離心(2000g,1-2hr)。然后將含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸鹽緩沖液中再次懸浮培養。這一步驟可濃縮病毒大約10倍,99%以上的病毒粒子可沉淀回收。
通過密度梯度離心zui終純化病毒。脊髓灰質炎病毒可以通過蔗糖或CSCl的密度梯度離心純化。在后者中,病毒在離心試管中成為一個分離帶,這一過程與對DNA的分離相同,離心須要高速,即120000g,且要進行好幾個小時,是一整夜。
離心管中的液體通過試管底部的一點點滴出來,要檢測每一滴的病毒滴度。在合適的離心條件下,所有的病毒分子都集聚在一或兩個組分中,所以它們是非常純的。結晶脊髓灰質炎病毒。
如果能在合適的條件下濃縮大量且高純度的病毒,就可以獲得病毒晶體。這種晶體為化學分析提供了很好的材料,且易于通過X射線衍射技術進行結構分析。
在開展人體病毒實驗工作以前,讓實驗工作人員獲得抵抗這種病毒的免疫力是非常必要的。脊髓灰質炎病毒疫苗很容易獲得,大多數工作人員可能已經獲得免疫,但重新免疫是必要的預防措施。
病毒的純化步驟主要是:
1.在大規模的裝置中培養病毒;
2.去除富含病毒培養液;
3.通過沉淀將病毒濃縮;
4.通過密度梯度離心zui終純化病毒。現在我們講解每個步驟的一些細節。
在大型裝置中培養細菌。為獲得足夠的用于化學研究的病毒,必須制備大量病毒。每種病毒的培養都有不同的步驟。脊髓灰質炎病毒是在人或靈長類動物細胞系中培養的,可以培養在一大瓶中沿壁生長的單層細胞上,也可以在一個輕輕攪拌的細胞懸液中。在有利病毒生長的條件下,每個宿主細胞能生產10~1000的感染單位的病毒,即每毫升一個感染單位的滴度(或稱效價)。
富含病毒培養液的去除。病毒的生長和釋放伴隨著細胞的破損。在病毒復制完成的時候,培養液中大多數細胞已經變成了細胞碎片。為使所有病毒分子*釋放,要通過反復冷凍—融化的循環過程使細胞進一步破碎。然后將富含病毒的液體從培養瓶轉移到離心試管中。低速離心除去大分子的細胞殘骸。