cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以*條DNA鏈為模板復制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。
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cDNA第二鏈的合成
1．將下列試劑直接加入大規模*鏈反應混合物中：
10 mmol/L MgCl2 70μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol） 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000單位/ml) 1μl
大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml) 4.5μl
溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。
2．溫育結束，將下列試劑加到反應混合物中：
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml) 1μl
室溫溫育15min。
3．溫育結束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合物室溫溫育15分鐘。
4．取出3μl反應物，按步驟7和8描述的方法測定第二鏈DNA的質量。
5．將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6．將下列試劑加到DNA溶液中：
10×T4多核苷酸激酶緩沖液 10μl
T4多核苷酸激酶（3000單位/ml） 1μl
室溫溫育15分鐘。
7．測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度，并按分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法測定1μl第二鏈合成產物中能被沉淀的放射性活度。
8．用下面公式計算第二鏈反應中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNA*鏈種的dNTP的量。
[第二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二鏈合成量/μg
x表示cDNA*鏈量。CDNA第二鏈合成量通常為*鏈量的70~80%
9．用等量酚：氯仿對含有磷酸化cDNA（來自步驟6）的反應物進行抽提。
10． Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和cDNA分開。
11． 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量離心機上以zui大速度4℃離心15分鐘，回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查，是否所有放射性都沉淀下來。
12． 用70%乙醇洗滌沉淀物，重復離心。
13． 小心吸出所有液體，空氣干燥沉淀物。
14． 如果需要用EcoR I甲基化酶對cDNA進行甲基化，可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要將cDNA直接與Not I或Sal I接頭或寡核苷酸銜接子相連，可將cDNA懸浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，盡快進行cDNA合成的下一步驟。
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