細(xì)胞:CaES-17細(xì)胞
中文名稱:人食管癌細(xì)胞
生長(zhǎng)特性:貼壁細(xì)胞
CaES-17細(xì)胞培養(yǎng)基:1640 培養(yǎng)基 血清:10%FBS(GIBCO胎牛血清)
凍存條件:50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基、40% FBS、10% DMSO
收到細(xì)胞后請(qǐng)盡快更換配套培養(yǎng)基,或自己配置的新鮮培養(yǎng)基(含15%血清),如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶培養(yǎng)基,請(qǐng)?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清(原瓶培養(yǎng)基的繼續(xù)使用時(shí)間最長(zhǎng)不宜超過(guò)72小時(shí))。
CaES-17細(xì)胞傳代:
1):細(xì)胞密度約80%時(shí),吸出原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次,加2~3 ml 0.25% yi酶進(jìn)行消化細(xì)胞(注意根據(jù)實(shí)際情況,把握消化時(shí)間)。
2):鏡下觀察消化情況,在細(xì)胞邊緣縮小,貼壁松動(dòng)時(shí);
(可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細(xì)胞層某處,即可肉眼可見細(xì)胞層脫落,或吹打后鏡下觀察吹打處,即消化完成,否則繼續(xù)消化)
直接吸掉yi酶,加3~4ml 培養(yǎng)基,輕輕吹打細(xì)胞層,把細(xì)胞層吹落,吹散。
3):取部分細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基,把細(xì)胞懸液打勻,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4):注意培養(yǎng)基PH值變化情況,定期換液(每周2-3次),待細(xì)胞密度達(dá)到80%以后重復(fù)1項(xiàng)操作或者凍存。
(網(wǎng)絡(luò)信息主針對(duì)網(wǎng)絡(luò)推廣作用,僅供參考,細(xì)胞培養(yǎng)請(qǐng)咨詢細(xì)胞庫(kù)管理員,以細(xì)胞庫(kù)管理員提供給您的信息為準(zhǔn),操作前,如果有不明白之處,先咨詢細(xì)胞庫(kù)管理員,避免不必要的損失;)
豬腦心肌炎病毒(EMCV)核酸擴(kuò)增檢測(cè) (RNA提取)
1.1樣品處理
腦、心肌等固體組織標(biāo)本:取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿或剪刀剪碎,加入500μl RNA提取液A(Trizol reagents),研磨或振蕩,轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中,室溫放置5min。
血清樣品或病毒液:取100 μl釋出血清或病毒液加入500μl RNA提取液A(Trizol reagents)充分震蕩,室溫放置5min。
1.2.加入100μl氯仿,用力震蕩15s,室溫靜置5min, 4℃ 13,000rpm離心5min。
1.3.小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中,加300 μl 無(wú)水乙醇,另加10μl RNA提取液B(內(nèi)含不溶物,使用前室溫溶解并充分混勻),充分混勻,13,000rpm離心1min。
1.4.棄上清,加入500 μl 75%的DEPC乙醇,充分混勻,13,000rpm離心1min,小心吸去大部分乙醇。
1.5.將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈,用20µl DEPC H2O溶解沉淀。
陰性質(zhì)控品:取100μl陰性質(zhì)控品加入500μl RNA提取液A(Trizol reagents)充分震蕩,后按1.2~1.5操作。
EMCV陽(yáng)性質(zhì)控品:直接取3μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
結(jié)果分析判定:
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值(3~8),stop值(13~18)以及Threshold值,使Std curve 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳(correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間,correlation數(shù)值等同于∣r∣值),最后到Reporter窗口下記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值(Qty-Copies/ml)。