細胞：CAKI-2細胞

中文名稱：人腎癌細胞

生長特性：貼壁細胞

CAKI-2細胞培養基：1640 培養基  血清：10%FBS（GIBCO胎牛血清）

凍存條件：50%基礎培養基、40% FBS、10% DMSO

收到細胞后請盡快更換配套培養基，或自己配置的新鮮培養基（含15%血清），如因特殊情況需要繼續使用原瓶培養基，請在原瓶培養基中額外添加10%的血清（原瓶培養基的繼續使用時間最長不宜超過72小時）。

CAKI-2細胞傳代：

1）：細胞密度約80%時，吸出原培養瓶中的培養基，PBS緩沖液潤洗細胞兩次，加2~3 ml 0.25% yi酶進行消化細胞（注意根據實際情況，把握消化時間）。

2）：鏡下觀察消化情況，在細胞邊緣縮小，貼壁松動時；

（可用吸管吸起些許yi酶輕輕吹打細胞層某處，即可肉眼可見細胞層脫落，或吹打后鏡下觀察吹打處，即消化完成，否則繼續消化）

直接吸掉yi酶，加3~4ml 培養基，輕輕吹打細胞層，把細胞層吹落，吹散。

3）：取部分細胞懸液轉移到新的培養皿中，添加適當的培養基，把細胞懸液打勻，于培養箱中培養。

4）：注意培養基PH值變化情況，定期換液（每周2-3次），待細胞密度達到80%以后重復1項操作或者凍存。

（網絡信息主針對網絡推廣作用，僅供參考，細胞培養請咨詢細胞庫管理員，以細胞庫管理員提供給您的信息為準，操作前，如果有不明白之處，先咨詢細胞庫管理員，避免不必要的損失；）

豬腦心肌炎病毒(EMCV)核酸擴增檢測標本（逆轉錄）

取出EMCV-RT MIX室溫溶解，向反應管中每管加入7μl EMCV-RT MIX，1μl逆轉錄酶系(使用前請10,000rpm瞬時離心30s)， 以及2μl 上述獲得的RNA。1,0000rpm瞬時離心30秒，將各反應管放入PCR儀器的反應槽內，在PCR儀上進行以下循環：42℃ 30分鐘，后98℃5分鐘滅活逆轉錄酶。

3．PCR擴增 

從試劑盒中取出EMCV-PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。

設所需要的PCR反應管管數為N（N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照），每個測試反應體系配制如下表：

（EMCV-PCR MIX 用量：24μl）（Taq酶系用量：2μl）  

計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設定的N個PCR反應管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品(cDNA)或EMCV-陽性定量標準品(使用前用陰性質控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質控品4μl，10,000rpm瞬時離心30秒。將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性質控品，陽性定量標準品以及未知標本，并設置反應體積(30μl)、樣品名稱、標記熒光基團種類(報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA)和循環條件：

ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯管)，MJ Opticon(使用8聯管)等使用薄壁管的儀器，循環條件： 94℃→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40個循環。

LightCycler等使用毛細管的儀器，循環條件： 94℃→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個循環。