BD培養(yǎng)基   RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作　　　　一、知識背景：　　1、基因表達(dá)：DNARNAProtein　　　　單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個蠶絲心蛋白基因104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白）共合成109個絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。　　　　2、PCR技術(shù)（polymerasechainreaction）：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。　　　　在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：　　　　A、變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；　　　　B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。　　　　C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。　　　　以上三步為一個循環(huán)，如此反復(fù)。　　　　3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR　　　　逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：　　　　1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA*條鏈；　　　　BD培養(yǎng)基   RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；　　　　3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以*條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.　　　　二、RT-PCR的準(zhǔn)備：　　　　1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：　　　　1）引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對于整個實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。　　　　2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括　　　　a、引物長度:一般為15～30bp，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的zui適延伸溫度會超過Taq酶的zui適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。　　　　b、堿基分布：四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。　　　　c、3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率zui低，G、C居中間，因此引物的3’端選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。　　　　d、引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。　　　　BD培養(yǎng)基   RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作e、引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補(bǔ)，3’端不應(yīng)超過2個。　　　　f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補(bǔ)堿基存在。　　　　g、5’端無嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離，但是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。