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逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):
1.在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂。
2. 為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對(duì)照。
3.內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動(dòng)蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4. PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期,出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。
5. 防止DNA的污染:① 采用DNA酶處理RNA樣品;② 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。
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