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各種緩沖液的制備
常用的緩沖液和試劑一般包括包被緩沖液、封閉緩沖液、洗滌緩沖液、樣品稀釋液、酶結合物緩沖液、底物緩沖液、終止液等,在研制試劑時,應根據試劑的種類、試劑的反應原理等,科學、合理選擇適當的緩沖液或試劑。
由于去垢劑可以減小緩沖液的表面張力,從而抑制緩沖液中蛋白質與微孔塑料之間的非特異性結合(Engvall and Perlmann,1972),因此,一般除包被緩沖液外,其他的緩沖液均可添加一定濃度的去垢劑,如Tween 20、Tween 40、Tween 80、grij 35,以及Triton X-100等,以提高試劑的特異性。目前使用zui廣泛的為Tween 20,其工作濃度一般不超過0.05%。
實際工作中,使用的包被緩沖液一般為碳酸鹽緩沖液(pH9.8,0.1mol/L),也有研究者稱,使用磷酸鹽緩沖液PBS(pH7,0.1mol/L),無論是否添加NaCl,均能獲得較好的包被效果。
封閉緩沖液可以使用磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液,但需要添加一定濃度(0.1%~1%)的封閉物,如明膠、酪蛋白、BSA、脫脂奶粉或者小牛血清。
孵育緩沖液包括樣品稀釋液和酶結合物緩沖液,一般使用中性或近中性的磷酸鹽緩沖液、磷酸/檸檬酸緩沖液以及Tris緩沖液。為了提高試劑的特異性,推薦使用PBS(至少0.05mol/L,NaCl濃度不高于0.3mol/L)。
洗滌緩沖液一般應和孵育緩沖液相同,但是不含有NaCl,而是添加去垢劑Tween應根據試劑所使用的酶,合理選擇底物緩沖液。不同的酶/底物系統需要不同的緩沖液,部分酶還需要特定的輔因子在zui適pH條件才能完成顯色反應。一般使用的酶大多數為HRP,其底物緩沖液中應添加非離子去垢劑,如Tween 20或Triton 100(Tijs-sen et al_,1985)。由于疊氮鈉是HRP的抑制劑,因此,在選擇防腐劑時,建議用0.1%硫柳汞代替疊氮鈉。
不同的酶/底物系統可能需要不同的終止液,使用HRP時,盡管疊氮鈉和NaCN均可用于終止顯色反應,但考慮安全性方面的原因,常用的終止液為硫酸(濃度4mol/L)。
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