操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：EGFR抑制劑(AZ-5104)

英文名稱：AZ-5104

產品規格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg

產品貨號：BJ-01X7895

細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

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EGFR抑制劑(AZ-5104)共價CDK7抑制劑(THZ1)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  THZ1250mL Maleate Buffer（馬來酸緩沖液）,0.2M,pH7.0  Maleate Buffer,0.2M,pH7.0  常溫保存

Aurora A抑制劑(Alisertib)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg  Alisertib25OD 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G 帽結構類似物 RNA Cap Structure Analogs -20℃保存

TGF-β抑制劑(A83-01)  5mg|10mg|50mg  A83-012 ug pMelBac B pMelBac B 低溫運輸，-20℃保存

IPI3K和mTOR抑制劑(BEZ235)  10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  BEZ2350.1mL×10 Origami B(DE3) plysS感受態細胞  Origami B (DE3) plysS Competent Cell -80℃保存

VEGFR(Flk-1/KDR)抑制劑  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg  SU541625g 多聚甲醛 Paraformaldehyde 密封干燥保存

HSP90抑制劑(17-AAG)  1mL(10mM)|10mg|25mg|100mg|200mg  17-AAG50T 人FGFR3 1138G/A多態性檢測試劑盒(PCR-RLFP)  低溫運輸，-20℃保存

ROCK-I和ROCK-II抑制劑(Y-27632)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  Y-2763225 mg TMRE Fluorescent Probe and Tracer -20℃保存

泛class IPI3K抑制劑  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  NVP-BKM120500mL Carbonate Buffered Saline（鹽緩沖鹽水）,5X,pH9.5  Carbonate Buffered Saline,5X,pH9.5  常溫保存

VEGFR1/2/3抑制劑(FGFR1/2/3抑制劑)(PDGFRα/β抑制劑)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  BIBF 112010mL 電泳級溴藍溶液 Bromophenol Blue Solution，EG 常溫避光干燥保存

HIF脯氨酰羥化酶抑制劑(FG-4592)  1mL(10mM)|10mg|50mg|100mg|200mg|500mg|1g  FG-45922 ug pHANNIBAL pHANNIBAL 低溫運輸，-20℃保存

caspase-3激活劑(細胞凋亡誘導劑)  1mg|2mg  Silvestrol沙氏葡萄糖肉湯培養基(EP) Sabouraud-dextrose Broth 250g