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貨號	BJ-01X6373

中文名稱：Caspase 8熒光法檢測試劑盒(AFC)

英文名稱：Caspase-8 Fluorescence Metric Assay

產品規格：20T|50T|100T

產品貨號：BJ-01X6373

本試劑盒適用于培養細胞及新鮮組織Caspase-8 檢測。Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-8 為關鍵的執行分子，與DNA 斷裂、染色質凝聚和凋亡小體形成有關。Caspase-8 在正常狀態下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性；但在細胞發生凋亡階段，它被激活，活化的Caspase-8 由兩個大亞基和兩個小亞基組成，裂解相應的胞漿胞核底物，終導致細胞凋亡。Caspase-8 熒光檢測試劑盒就是將Caspase-8 序列特異性的多肽偶聯至發色基團。當底物被Caspase-8 剪切后，發色基團即游離出來，可通過熒光酶標儀測定其熒光強度（激發波長=485nm,發射波長=535nm）。

注意事項

1. Caspase-8 Substrate 避光保存及使用。

2. 對某些凋亡誘導劑引起的細胞凋亡可能存在非依賴于Caspase-8 活化的機制，這種情況時利用本試劑盒檢測Caspase-8 活性無明顯改變，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

3. 細胞數量需達到3~5×106 個或新鮮組織50~100mg，以便能達到測定需要的100~200μg 蛋白的要求，因為Caspase-8 的活性與細胞裂解液的蛋白含量有關，如測定的RFU 值偏低，可以通過適當延長反應的時間，如果值還是不高，可通過增加細胞數量或組織量的方法來提高蛋白量。

細胞培養操作規程：

一．培養基及培養凍存條件準備：

1）準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

QQ截圖20220509112004.png

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

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操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)