創(chuàng)傷弧菌(VV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
創(chuàng)傷弧菌(VV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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創(chuàng)傷弧菌(VV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書1、什么是定量PCR？
以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)?/span>PCR過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而達(dá)到評(píng)估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。
2、定量PCR定量的理論依據(jù)是什么？
特定的待擴(kuò)增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴(kuò)增過(guò)程越短，當(dāng)擴(kuò)增速率趨于穩(wěn)定后，則無(wú)論原來(lái)樣品中起始模板含量多少，終擴(kuò)增片段的含量通常是一樣的。
理想的擴(kuò)增結(jié)果：Y=X×2n 其中Y代表擴(kuò)增產(chǎn)物量， X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù) n為擴(kuò)增次數(shù)；理論上PCR擴(kuò)增效率為*，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長(zhǎng)，但實(shí)際上：DNA的每一次復(fù)制都不*，即每一次擴(kuò)增中，模板不是呈2的倍增長(zhǎng)；實(shí)際應(yīng)為：Y= X(1+E)n ，其中E 代表擴(kuò)增效率：E = 參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中不是固定不變的。通常X 在 1～105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時(shí)，E 相對(duì)穩(wěn)定，原始模板以相對(duì)固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y 呈非固定的指數(shù)形式增加，后進(jìn)入平臺(tái)期。
3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么？
PCR是對(duì)原始待測(cè)模板核酸的一個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，任何干擾PCR指數(shù)擴(kuò)增的因素都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，使得PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒(méi)有一個(gè)固定的比例關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增終產(chǎn)物很難對(duì)原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來(lái)研究人員通過(guò)大量的實(shí)踐，研究了相對(duì)準(zhǔn)確的定量PCR方法，即熒光定量PCR。
PCR擴(kuò)增通式： ① Tn=T0（1+E）n
② Tn=Tn-1（1+E）n 注：[0
其中E表示擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù)，Tn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，Tn-1表示在n-1個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴于某一循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識(shí)別，此時(shí)的循環(huán)數(shù)為CP（crossing point）,也就是K= T0（1+E）CP，取對(duì)數(shù)即：
lg K=lg T0+CP*lg(1+E)
CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
由于對(duì)一特定的PCR而言，E與K均為常數(shù)，故上式為循環(huán)數(shù)（CP）對(duì)原始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（lg T0）一次方程，其標(biāo)準(zhǔn)形式y=kx+b,該直線的斜率為- 1/lg(1+E)，在橫坐標(biāo)上的截距為lgk/lg(1+E)，也是熒光定量PCR所謂的標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如下圖為單管實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線：
創(chuàng)傷弧菌(VV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書目前熒光定量PCR均采用外標(biāo)定量
外標(biāo)法定量PCR擴(kuò)增效率的計(jì)算，由于標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(Slope)為- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ,如從標(biāo)準(zhǔn)曲線中知道Slope=-3.337,則可推知擴(kuò)增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者將(1+E)直接視為擴(kuò)增效率E，則E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之間，有時(shí)也有大于2的結(jié)果，如下圖所示。另外也可直接根據(jù)系列稀釋外標(biāo)在該次實(shí)時(shí)熒光PCR的結(jié)果來(lái)大略分析擴(kuò)增效率的高低，例如系列10倍稀釋外標(biāo)在PCR擴(kuò)增時(shí)有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在擴(kuò)增到指數(shù)期時(shí)熒光值相同則代表此點(diǎn)的終末拷貝數(shù)相同，即N2=N3，En2-n3=10,取對(duì)數(shù)得到⊿ngE=1, E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32; E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。
根據(jù)PCR擴(kuò)增過(guò)程中是否加入某種標(biāo)記物、標(biāo)記物的種類以及后檢測(cè)的信號(hào)的不同可分為四種類型：①直接定量檢測(cè)法， ②同位素標(biāo)記定量，③酶標(biāo)記定量檢測(cè)法，④熒光定量PCR技術(shù)
熒光定量PCR 主要原理發(fā)射波長(zhǎng)與受體熒光染料光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長(zhǎng)的熒光，同時(shí)將供體熒光淬滅。SYBR Green I 檢測(cè)模式
SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光大增強(qiáng)。因此， SYBR Green I的檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)大約為520nm。PCR擴(kuò)增程序一般為94℃～55℃～72℃三步法，40個(gè)循環(huán)。
SYBR Green I 的缺點(diǎn)：由于SYBR Green I沒(méi)有特異性，不能識(shí)別特定的雙鏈，只要是雙鏈就會(huì)結(jié)合發(fā)光，對(duì)PCR反應(yīng)中的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體也會(huì)產(chǎn)生熒光，通常本所以在臨床上使用可能會(huì)有假陽(yáng)性發(fā)生。 SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的這對(duì)科研是很有利的，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
5、為什么要用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量？它與傳統(tǒng)的定量PCR有什么不同？
如前所述的，傳統(tǒng)的定量PCR有很多，主要是倍比稀釋法、內(nèi)參照法、競(jìng)爭(zhēng)法、PCR-ELISA法，但這些定量PCR技術(shù)的難點(diǎn)主要在于：（1）如何確定PCR正處于線性擴(kuò)增范圍內(nèi)（只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號(hào)才與初始模板的拷貝數(shù)成比例）。（2）一旦線性擴(kuò)增范圍確定以后，如何找到一個(gè)合適的方法檢測(cè)結(jié)果。為了保證線性，研究者要擴(kuò)增一系列梯度稀釋的cDNA或者對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；有的研究者加一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性模板，有的做限制性的稀釋梯度分析，或者加一個(gè)PCR模擬（mimic）反應(yīng)，即用相似的引物與目標(biāo)產(chǎn)物共擴(kuò)增，而擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)通常在跑膠以后通過(guò)染料、放射活性或者探針進(jìn)行檢測(cè)。（3）大多數(shù)是終點(diǎn)檢測(cè)，即PCR到達(dá)平臺(tái)期后進(jìn)行檢測(cè)，而PCR經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，檢測(cè)重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異（如下圖所示），因此無(wú)法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量；雖然加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以傳統(tǒng)定量PCR的缺點(diǎn)是：勞動(dòng)強(qiáng)度大、定量不準(zhǔn)確、重復(fù)性差。
急性子 The ace 4g

皇豆皇速Glycitqin40927-83-3HPLC≥98%，20mg/vial

補(bǔ)充中 Hederagenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→2)-α-L-arabinopyranoside 123350-57-2 ≥ 98% 20 mg/支

黃芪甲甙;黃芪皂苷IV黃芪甲苷84687-43-4Asagaloside IV

參皂苷Rh1;參皂甙Rh1 Ginsenoside Rh1 63223-86-9 20mg HPLC≥98% 用于含量測(cè)定

金果欖 Jin Guolan 0.1g

西紅花苷IICrocinII22720-84-0HPLC≥98%，20mg/vial

Sitostenone SITOSTENONE 1058-61-3

效價(jià)測(cè)定可溶性淀粉140602-200313常溫，避光10g

* Camptothecine 2114454 20mg HPLC≥98% 用于含量測(cè)定

薯蕷皂甙 Dioscin 19057-60-4 10MG 標(biāo)準(zhǔn)品

商陸Phytolacca esculenta van Hote 商陸皂苷甲 65497-07-6 C42H66O16 ≥98% 賣角溴煙酯;泥賣角林 - 對(duì)照譜圖(Y0000287

Myricetin楊梅素529-44-2楊梅黃酮;楊梅酮20mg/支

噻嘧啶相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品25mg

半枝蓮Scellaria barbata Aurantiamide 橙黃胡椒酰胺乙酸酯 58115-31-4 C25H26N2O3 ≥95%

ISTRambachagarRambach瓊脂1.07500.0001MERCK默克incubationmediaISTRambachagarRambach瓊脂1.07500.0001MERCK默克  進(jìn)口分裝  8-氧黃連堿  標(biāo)準(zhǔn)品別名：    英文名稱：    CAS 編號(hào)：

DRBCAgar(DichloranRoseBengalChloramphenicol)incubationmediaDRBCAgar(DichloranRoseBengalChloramphenicol)  進(jìn)口分裝  N,N’-二甲基蝙蝠葛堿化物  標(biāo)準(zhǔn)品別名：    英文名稱：  N,N’-dimethyldauricine iodide  CAS 編號(hào)：

FraserBrothBaseincubationmediaFraserBrothBase  進(jìn)口分裝  雙胺草酸鹽  標(biāo)準(zhǔn)品別名：  二胺  英文名稱：  4-Amino-4-Methylpentan-2-onehydrogenoxalate  CAS 編號(hào)：  625-04-7

RVS大豆肉湯用于沙門氏菌選擇性增菌500gincubationmediaRVS大豆肉湯用于沙門氏菌選擇性增菌500g  進(jìn)口分裝  白花前胡丙素  標(biāo)準(zhǔn)品別名：    英文名稱：  Praeruptorin C  CAS 編號(hào)：  83382-71-2

人輪狀病毒抗原elisa試劑盒  進(jìn)口分裝  黃芪總皂苷（標(biāo)準(zhǔn)品）  Astragaloside  CAS號(hào)：  17429-69-5  質(zhì)量規(guī)格：  UV≥98%，標(biāo)準(zhǔn)品

人淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物基因座Aelisa試劑盒  進(jìn)口分裝  *,辣椒素(天然提取)  Capsaicin  CAS號(hào)：  404-86-4  質(zhì)量規(guī)格：  辣椒總堿>98%,辣椒單堿>55%

人類白細(xì)胞抗原Eelisa試劑盒  進(jìn)口分裝  綠原酸  Chlorogenic acid  CAS號(hào)：  327-97-9  質(zhì)量規(guī)格：

創(chuàng)傷弧菌(VV)核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書人*受體1(SSTR1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒  進(jìn)口分裝   直接紅81  英文名稱：  Direct red 81  CAS號(hào)：  259636  分子式：  675.6  分子量：   C29H19N5Na2O8S2

人生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白10(Grb10)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒  進(jìn)口分裝   天狼猩紅  英文名稱：  Sirius red  CAS號(hào)：  259604  分子式：  1373.07  分子量：   C45H26N10Na6O21S6

人生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白14(Grb14)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒  進(jìn)口分裝   活性艷藍(lán)KN-R  英文名稱：  Reactive brilliant blue KN-R  CAS號(hào)：  2580-78-1  分子式：  626.54  分子量：   C22H16N2Na2O11S3

人生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒  進(jìn)口分裝   媒介2B  英文名稱：  Media black 2B  CAS號(hào)：  25747-08-4  分子式：  439.4  分子量：   C20H13N3O7S