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更新時間:2018-11-23 15:51:54瀏覽次數(shù):367次
聯(lián)系我時,請告知來自 智慧城市網(wǎng)羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法,購買本公司試劑盒,提供免費實驗室檢測,免費待測。方便快捷。
羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;剛開始時, 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設置復孔,則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標,標準品的濃度為縱坐標,繪出標準曲線。
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羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法1、什么是定量PCR?
以參照物為標準,對PCR終產(chǎn)物進行分析或?qū)?/span>PCR過程進行監(jiān)測,從而達到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù),稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數(shù)期進行的。
2、定量PCR定量的理論依據(jù)是什么?
特定的待擴增基因片段起始含量越大,則指數(shù)擴增過程越短,當擴增速率趨于穩(wěn)定后,則無論原來樣品中起始模板含量多少,終擴增片段的含量通常是一樣的。
理想的擴增結(jié)果:Y=X×2n 其中Y代表擴增產(chǎn)物量, X代表PCR反應體中的原始模板數(shù) n為擴增次數(shù);理論上PCR擴增效率為*,PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進行成指數(shù)增長,但實際上:DNA的每一次復制都不*,即每一次擴增中,模板不是呈2的倍增長;實際應為:Y= X(1+E)n ,其中E 代表擴增效率:E = 參與復制的模板/總模板,通常E≤1,E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X 在 1~105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時,E 相對穩(wěn)定,原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加,適合定量分析,這也就是所謂的指數(shù)期;隨著循環(huán)次數(shù)n的增加(>30次),E值逐漸減少,Y 呈非固定的指數(shù)形式增加,后進入平臺期。
3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么?
PCR是對原始待測模板核酸的一個擴增過程,任何干擾PCR指數(shù)擴增的因素都會影響擴增產(chǎn)物的量,使得PCR擴增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒有一個固定的比例關系,通過檢測擴增終產(chǎn)物很難對原始模板進行準確定量。近年來研究人員通過大量的實踐,研究了相對準確的定量PCR方法,即熒光定量PCR。
PCR擴增通式: ① Tn=T0(1+E)n
② Tn=Tn-1(1+E)n 注:[0
其中E表示擴增效率,n為循環(huán)數(shù),Tn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量,Tn-1表示在n-1個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量,T0為原始模板數(shù)量。設定PCR到達指數(shù)擴增期時,產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴于某一循環(huán)擴增產(chǎn)物的總量,即特定的拷貝數(shù)K,為常數(shù),大約在1010左右)高于背景為儀器所識別,此時的循環(huán)數(shù)為CP(crossing point),也就是K= T0(1+E)CP,取對數(shù)即:
lg K=lg T0+CP*lg(1+E)
CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
由于對一特定的PCR而言,E與K均為常數(shù),故上式為循環(huán)數(shù)(CP)對原始模板拷貝數(shù)的對數(shù)(lg T0)一次方程,其標準形式y=kx+b,該直線的斜率為- 1/lg(1+E),在橫坐標上的截距為lgk/lg(1+E),也是熒光定量PCR所謂的標準曲線。例如下圖為單管實時熒光定量RT-PCR的標準曲線:
羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法目前熒光定量PCR均采用外標定量
外標法定量PCR擴增效率的計算,由于標準曲線的斜率(Slope)為- 1/lg(1+E),可知E=10-1/Slope-1 ,如從標準曲線中知道Slope=-3.337,則可推知擴增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者將(1+E)直接視為擴增效率E,則E=10-1/Slope,求得的E值均在1—2之間,有時也有大于2的結(jié)果,如下圖所示。另外也可直接根據(jù)系列稀釋外標在該次實時熒光PCR的結(jié)果來大略分析擴增效率的高低,例如系列10倍稀釋外標在PCR擴增時有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在擴增到指數(shù)期時熒光值相同則代表此點的終末拷貝數(shù)相同,即N2=N3,En2-n3=10,取對數(shù)得到⊿ngE=1, E=101/⊿n,E=2,⊿n=3.32; E=1.8,⊿n=3.91.反之亦然。
根據(jù)PCR擴增過程中是否加入某種標記物、標記物的種類以及后檢測的信號的不同可分為四種類型:①直接定量檢測法, ②同位素標記定量,③酶標記定量檢測法,④熒光定量PCR技術(shù)
熒光定量PCR 主要原理發(fā)射波長與受體熒光染料光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長的熒光,同時將供體熒光淬滅。SYBR Green I 檢測模式
SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光大增強。因此, SYBR Green I的檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的大吸收波長約為497nm,發(fā)射波長大約為520nm。PCR擴增程序一般為94℃~55℃~72℃三步法,40個循環(huán)。
SYBR Green I 的缺點:由于SYBR Green I沒有特異性,不能識別特定的雙鏈,只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光,對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光,通常本所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生。 SYBR Green I的優(yōu)點:SYBR Green I的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生,由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合,所以對不同模板不需特別定制不同的這對科研是很有利的,因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。
5、為什么要用熒光定量PCR技術(shù)進行定量?它與傳統(tǒng)的定量PCR有什么不同?
如前所述的,傳統(tǒng)的定量PCR有很多,主要是倍比稀釋法、內(nèi)參照法、競爭法、PCR-ELISA法,但這些定量PCR技術(shù)的難點主要在于:(1)如何確定PCR正處于線性擴增范圍內(nèi)(只有在此范圍內(nèi)PCR產(chǎn)物信號才與初始模板的拷貝數(shù)成比例)。(2)一旦線性擴增范圍確定以后,如何找到一個合適的方法檢測結(jié)果。為了保證線性,研究者要擴增一系列梯度稀釋的cDNA或者對每個基因的擴增循環(huán)數(shù)作適當?shù)恼{(diào)整;有的研究者加一個競爭性模板,有的做限制性的稀釋梯度分析,或者加一個PCR模擬(mimic)反應,即用相似的引物與目標產(chǎn)物共擴增,而擴增產(chǎn)物的檢測通常在跑膠以后通過染料、放射活性或者探針進行檢測。(3)大多數(shù)是終點檢測,即PCR到達平臺期后進行檢測,而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時,檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗,所得結(jié)果有很大差異(如下圖所示),因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量;雖然加入內(nèi)標后,可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此,傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法,所以傳統(tǒng)定量PCR的缺點是:勞動強度大、定量不準確、重復性差。
威靈仙(綿團鐵線蓮) Clematis(Clematiswoollygroup) 2.5g
(E,E)-3,7-二基-10-(1-(q,q)-3,7-twomqthyl-10-(1-690-91-6HPLC≥98%,20mg/vial
Gold Taq DNA聚合酶 Gold Taq DNA聚合酶 暫不提供 暫不提供 250U,500U
含量測定*130520-2009022-8℃,避光100mg
酚;山柰酚;3,4',5,7-四羥基黃酮 Kaempferol 520-18-3 20mg HPLC≥98% 用于含量測定
51-52-5 丙基硫氧嘧啶標準品 200mg
五味子酯SchisandrinB28246-22-7HPLC≥98%,20mg/支
YohiMbine 育亨賓 146-48-5
滅菌唑 標準品 CAS號:131983-72-7 10MG
山豆根色滿二氫黃酮Ⅰ HPLC≥98%;20mg 訂購|咨詢
根皮素 60-82-2 檢測用對照品 無
刺桐Erythrina arborescens 3,4-二輕-5-輕基-9-(4-輕基本基)-2,2-二甲基-2H,10H-本并[1,2-b:3,4-b']二-10-同 65388-03-6 C20H18O5 ≥98% 異心烷中15種有機錄混合溶液標準物質(zhì)( 702
告達亭苷元告達亭甙元20mg/支
美司那相關物質(zhì)A標準品50mg
爆杖花'Rhododendron spinuliferum Daurichromenic acid (2S)-2-[(3E)-4,8-二甲基-3,7-壬二烯-1-基]-5-羥基-2,7-二甲基-2H-1-本并-6-羧酸 82003-90-5 C23H30O4 ≥95%
Cary-BlairTransportMedium 進口分裝 環(huán)己烷(色譜級) Cyclohexane CAS號: 110-82-7 質(zhì)量規(guī)格: for HPLC,≥99.9%
LactosePeptoroth 進口分裝 石油醚(色譜級) Petroleum CAS號: 8032-32-4 質(zhì)量規(guī)格: for HPLC,bp 30-60 °C
*麥康凱瓊脂添加劑1ml*5每200mlHB0121培養(yǎng)基中添加1支(含*0.01mg和亞碲酸鉀0.5mg) 進口分裝 1-十三烷磺酸[離子對色譜級] IPC-ALKS-13 CAS號: 5802-89-1 質(zhì)量規(guī)格: 離子對色譜用試劑
TTC營養(yǎng)瓊脂 進口分裝 鉍試劑Ⅱ(CP) Bismuthiol II CAS號: 6336-51-2 質(zhì)量規(guī)格: CP
人基質(zhì)裂解蛋白/基質(zhì)溶素(MAT)ELISAKit 進口分裝 Fmoc-3-苯甲酰-赤-鞘醇 Fmoc-3-benzoyl-erythro-sphingosine CAS號: 676485-58-8 質(zhì)量規(guī)格: 美國進口
人巨噬細胞刺激蛋白(MSP)ELISAKit 進口分裝 4-去甲氧基-4-硝基*硫化物 4-Desmethoxy-4-nitro Omeprazole Sulfide CAS號: 142885-91-4 質(zhì)量規(guī)格: 美國進口
小鼠白介素4(IL-4)EL
羊特定基因序列(Ovine)核酸檢測試劑盒方法腦肽前體 進口分裝 戊菊酯 英文名稱: Fluoride and cyanide CAS號: 70124-77-5 分子式: 451.46 分子量: C26H23F2NO4
骨涎蛋白 進口分裝 禾草敵 英文名稱: Molinate CAS號: 2212-67-1 分子式: 187.3 分子量: C9H17NOS
β細胞素 進口分裝 硫線磷 英文名稱: Cadusafos CAS號: 95465-99-9 分子式: 270.39 分子量: C10H23O2PS2
T細胞抑制因子 進口分裝 異辛烷中7種有機混和溶液 英文名稱: 7 kinds of organic pesticides mixed solution CAS號: 分子式: 分子量:
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