目的要求：

（1）了解克隆基因表達的方法和意義。

（2）了解重組蛋白親和層析分離純化的方法。

實驗原理：

克隆基因在細胞中表達對理論研究和實驗應用都具有重要的意義。通過表達能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，同時克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。大腸桿菌是目前應用廣泛的蛋白質表達系統，其表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。本實驗中，攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導下，超量表達攜帶有6個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白，該蛋白可用一種通過共價偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質加以提純，實為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

試劑和器材：

一、試劑

[1] LB液體培養基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸餾水配至1000mL.

[2] 氨芐青霉素：100mg/mL

[3] 上樣

緩沖液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0

[4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3

[5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0

[6] IPTG

二、器材：

搖床，離心機，層析柱（1′10 cm）

操作方法：

一、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導

1. 接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5mL LB液體培養基中（含100ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養過夜。

2. 轉接1mL過夜培養物于100mL（含100ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養基中，37℃震蕩培養至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。

3. 加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l, 37℃繼續培養1-3h.

4. 12，000rpm 離心10 min, 棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

二、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化

1. NTA層析柱的準備：在層析柱中加入1mL NTA介質，并分別用8mL 去離子水，8mL上樣緩沖液洗滌。

2. 重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5mL上樣緩沖液, 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60min, 4℃ 12000rpm 離心 30 min, 將上清吸至一個干凈的容器中，并棄沉淀。取10ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。

3. 上清樣品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。

4. 洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脫液，約3-4h,取10ul洗脫開始時的樣品用于SDS-PAGE 分析。

5. 洗脫目標蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級分，分別取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。