驗證抗體對于結果的一致性和重復性是至關重要的，即確認抗體能特異性識別感興趣的蛋白，抗體與其他蛋白的交叉反應性Qing況。在您的論文提交給期刊發表之前，經常需要驗證抗體的特異性，但并非所有人都花時間進行驗證。或者很多人都認為他們使用抗體進行了免疫共沉淀驗證，因而不需要再通過蛋白質印跡進行驗證。然而，抗體與抗原的親和性高度依賴于實驗條件，因此，驗證您的試驗方法中的條件適用于抗體與抗原的結合是十分重要的。

定量western blot尤其適用于確認獲得的信號僅來自感興趣的蛋白。如果沒有進行抗體驗證（并且驗證熒光信號與蛋白質的量呈線性關系），將無法獲得下游定量分析所需的準確度和度。

為確保實驗質量，抗體驗證工作組提供了五種不同的抗體驗證方法，其中四種方法適用于western blot，他們建議至少使用其中兩種方法進行抗體驗證。
 

遺傳策略

盡管這些方法已經被更新了，但在科研領域中的生物化學家對他們應該都很熟悉。即用CRISPR-Cas9或RNA干擾（RNAi）在實驗組和對照組中進行敲除或敲低實驗，然后使用特異性抗體測定目標蛋白的熒光信號。處理后的目標蛋白質的表達很少甚至沒有，所以觀察到的任何信號都表明抗體存在交叉反應性。

如下圖所示，將具有特定蛋白質的細胞裂解物進行western blot，分別使用兩種不同siRNA分子敲低目的蛋白的表達，如泳道1和泳道2，與泳道C的對照組相比，我們可以看出siRNA脫靶帶來的影響。

正交策略

這種方法的技術含量較低，它使用不依賴于抗體的方法（質譜法）來量化幾個蛋白樣品的靶信號，然后使用基于抗體的方法（western blot）同樣量化相同蛋白樣品的靶信號，后將他們的信號值進行比較。例如，有幾種靶向蛋白質組學方法可以量化不同樣品中的蛋白質表達。當對抗體進行標記時應參考這些相關的定量數據。

下圖比較了蛋白質印跡和質譜法測定蛋白表達量的相關性。通過對八種細胞系中蛋白表達量的測定，我們可以看到他們的相關性高達0.97，表明該抗體對于蛋白質印跡分析是有效的。

獨立抗體策略

使用針對相同靶標的兩種或更多種不同抗體是測量抗體特異性的直觀且有效的方法。在相同的實驗條件中測定抗體相關性十分重要。如果抗體具有不同的抗體表位（即抗體結合抗原的不同區域）則表明該抗體是獨立的。這樣，它們不可能表現出脫靶效應并結合與該研究無關的同一蛋白質，這種方法可結合敲除或敲低的方法一起使用。

如下圖，對目的蛋白使用了兩種獨立的抗體，并且我們可以確定來自八種細胞系中的每一種信號的相關性。注意要檢查整塊凝膠，因為脫靶效應帶來的結果是非特異條帶可能在整塊膠的任意位置。

表達帶有標簽的蛋白

還可以通過表達具有親和標簽（例如FLAG或v5）或熒光蛋白（例如GFP或YFP）的蛋白質來驗證抗體。然后可以使抗體表達與另一種方法的表達相匹配，但是這種方法局限性在于標記內源基因。值得注意的是過表達目標蛋白可能會人為地淹沒脫靶結合，然后無法驗證抗體。

驗證抗體對于western blot實驗十分重要，并且western反過來可以用來驗證ELISA或者IHC。

Azure有兩種產品可幫助確認您的抗體是否具有特異性和選擇性結合：

（1）HRP偶聯的二抗：可用來檢測化學發光WB中的低豐度蛋白質；
（2）熒光二抗：在熒光Western blot中發射可見光和近紅外波長的光。