2013年，哈佛醫學院的研究人員曾在《Nature Review Genetics》雜志上發表了一篇很有意思的綜述，討論了新一代測序（NGS）實驗中錯誤的來源¹。文章指出，在樣品制備和文庫制備環節，用戶操作失誤（user error）都是常有的事，比如貼錯標簽或者加錯溶液。

然而，測序畢竟不同于核酸純化，后者失敗了大不了重做。對測序而言，一個簡單的移液或混合錯誤有可能讓你付出高昂的代價。無論老板是否nice，測序實驗從頭再來的感受肯定不佳，實驗室需要耗費大量的時間和成本，況且有些樣本還很稀有。不過，每次要處理那么多的樣本，即使打起十二分精神，還是難保不出錯。

為了避免操作失誤的發生，賽默飛想到了一個絕妙的好辦法。Invitrogen Collibri系列文庫制備試劑盒中的每種試劑都帶有一種示蹤染料，便于人們清晰觀察文庫制備過程。若你看到溶液均勻變色（比如從藍色變為綠色，圖1），則可以確信相關試劑已添加且*混勻。若是漏加了某種試劑，或者沒有混合均勻，則觀察不到預期的顏色變化。

圖1. Collibri PS DNA文庫制備試劑盒的顏色變化

不用擔心，試劑中的惰性染料既不會干擾酶促反應，也不會影響測序結果。后純化所得的文庫是澄清透明的。這種實時的顏色變化提示，讓操作失誤的可能性大大降低，也讓你對文庫制備的過程充滿信心。

看到這里，你一定想知道，Collibri系列文庫制備試劑盒包含哪些產品，適合哪些應用？其實，針對全基因組測序和轉錄組測序，此系列都有相應的試劑盒提供，均適用于Illumina的高通量測序儀。下面就讓小編來一一介紹。

全基因組測序

? Collibri PS DNA文庫制備試劑盒適用于物理片段化的基因組，支持1-1,000 ng的樣本起始量
? Collibri PCR-Free PS DNA文庫制備試劑盒同樣適用于物理片段化的基因組，采用PCR-free的實驗方案，支持500-1,000 ng的樣本起始量
? Collibri ES DNA文庫制備試劑盒適用于酶法片段化的基因組，支持1-500 ng的樣本起始量
? Collibri PCR-Free ES DNA文庫制備試劑盒同樣支持酶法片段化的基因組，采用PCR-free的實驗方案，支持100-500 ng的樣本起始量

根據片段化方式的不同，Collibri DNA文庫制備試劑盒可分為兩大類：物理片段化（PS）和酶法片段化（ES）。物理方法片段化主要是利用機械破碎的方法將基因組隨機打斷，如超聲破碎、霧化等。酶學方法片段化主要利用酶的剪切功能將基因組片段化。酶法片段化方式操作簡單，但物理片段化方式的片段隨機性更好。此外，每種試劑盒都有PCR擴增產品和PCR-free產品可選。

與同類產品相比，Collibri系列文庫制備試劑盒能夠在更短時間內完成建庫。以Collibri PCR-Free PS DNA文庫制備試劑盒為例，文庫制備可在1.5小時內完成，而整個實驗流程的總時間縮短至6.5小時。其他產品一般需要7小時以上，甚至超過10小時。

若起始材料有限，可以選擇PCR方案。不管是PCR-free文庫還是經PCR擴增的文庫，都可以始終保持均一的GC覆蓋度，將GC bias降至低。即使是“測序困難戶”，如bad promoters或GC含量高達75%的區域，覆蓋度也優于同類產品，包括FFPE樣本。這種高覆蓋度使得突變檢測的靈敏度和準確度得到增強。

經過實驗證實，Collibri DNA文庫制備試劑盒能夠地檢測新生突變（De Novo mutations）。不管是PCR方案還是PCR-free方案，它們都能夠檢測SNP，對于10 ng及以上的起始DNA樣本量，Collibri PS DNA文庫制備試劑盒的SNP recall高于98.8%（圖2）。此外，即使是低起始量樣本，插入突變檢測的indel recall也高于同類產品。

Collibri DNA文庫制備試劑盒包含了WGS文庫構建所需的所有組分，除了核心酶組分以外，還包括磁珠及經特殊設計的indexed adaptors，無需再單獨購買。試劑盒隨附提供*雙端index（UDI）。與傳統的CDI相比，UDI的使用大大降低了標簽串擾（index hopping）的比例。

圖2. 檢測突變

全轉錄組測序

Collibri RNA測序建庫流程不同于市面上一般的RNA-Seq建庫流程。RNA經酶片段化后直接與adaptor（含有輔助oligo）連接，之后逆轉錄形成cDNA，后再通過PCR擴增引入index（圖3）。

這種*的建庫流程可保留樣本的復雜度，適用于不同質量的樣本類型，如完整RNA、降解RNA、FFPE樣本等。使用統一引物進行cDNA合成，不會受GC含量的影響，且無需引入隨機Oligo序列，避免檢測SNP或點突變時出現假陽性。

圖3. Collibri RNA測序建庫流程

Collibr™ Stranded RNA文庫制備試劑盒同樣能夠實現快速建庫。包括rRNA去除在內，轉錄組文庫構建可在6.5小時內完成。這樣使得從RNA提取到文庫構建完成的總時間縮短至10.5小時左右。

可選的Collibri H/M/R rRNA Depletion Kit還能從100-1000 ng人、小鼠或大鼠總RNA中去除rRNA。與市面上其它rRNA去除方法不同，這種試劑盒基于親和探針雜交和磁珠純化方法，可特異地去除rRNA序列。探針的數量和靶向位置均經精心設計，可以去除28S、18S、5.8S、45S、5S、mt16S和mt12S核糖體序列。

Collibri RNA文庫制備試劑盒內包含RNA-Seq文庫構建所需的所有組分，除了片段化酶、RNA末端修飾試劑、Adaptor、連接酶、反轉錄試劑、文庫擴增試劑外，還包含rRNA去除試劑、純化磁珠以及index primer等。

文庫定量

基于qPCR的Collibri文庫定量試劑盒能夠對文庫有效濃度進行準確定量，適合大批量樣本的文庫定量。該試劑盒包含Collibri文庫定量預混液、Collibri DNA標準品和Collibri文庫稀釋緩沖液。在文庫定量時，使用一組6個預先稀釋的DNA參考標準品來生成標準曲線，通過這一標準曲線可測定樣本文庫濃度。

基于Invitrogen™ Platinum™ II Taq 熱啟動DNA聚合酶的qPCR預混液含有靶向Illumina P5和P7 Adaptor序列的引物。Platinum II Taq 熱啟動DNA聚合酶可以均勻擴增GC含量不同和長短各異的DNA片段，因此是定量測序文庫的理想選擇。

與熒光檢測方法相比，qPCR檢測近測定含有P5和P7 Adaptor的文庫片段，因此能夠更加特異和準確地檢測NGS測序文庫。Collibri檢測十分靈敏，可以定量飛摩爾量級的片段文庫。起始量要求極低，通常僅需4 μL稀釋的文庫樣本，濃度>0.0002 pM即可。同樣，顏色指示可降低反應配制期間移液錯誤的風險。