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不知不覺地,生物實驗的規(guī)模正在逐漸變小,而通量正在逐漸變大。以往那些龐大的儀器正被手持設(shè)備或硅制芯片所取代,試劑的單位從毫升轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸蚣{升;而重復(fù)數(shù)量也從兩三個變?yōu)?6孔、384孔甚至1536孔。因此,實驗重點也從生物體轉(zhuǎn)換到組織再到細胞和細胞器,包括細胞核。
從2011年開始,有關(guān)單細胞核測序的論文開始出現(xiàn)。通過谷ge學(xué)術(shù)檢索,第一篇相關(guān)論文是2011年的一項腫瘤進化研究,同年晚些時候還有一篇苔蘚基因靶向分析的研究發(fā)表。2012年,它被用于腫瘤的拷貝數(shù)變異分析。
近兩年,單細胞核測序領(lǐng)域開始迅猛發(fā)展。2018年,僅僅單核RNA-seq(snRNA-seq)就有160多篇論文發(fā)表。這是一種相對較新的方法,分析的是細胞核,而不是完整的細胞。它能夠?qū)﹄y以分離的細胞開展基因表達分析。
snRNA-seq采用微流體技術(shù),將帶有條形碼的微珠和單個細胞核一起裝入微小的液滴內(nèi)。這些液滴作為納升級的反應(yīng)管,實現(xiàn)了成千上萬個細胞核分離和建庫,從而大幅降低了建庫的成本。
在有些情況下,細胞是很難完整分離的,比如長期保存的組織,或者大腦細胞和脂肪細胞。在分離細胞時所用的酶和破壞力往往會影響其他細胞區(qū)室的內(nèi)容。此時,單核RNA測序就顯得特別重要。
單核RNA測序有哪些優(yōu)勢?
根據(jù)我們的直覺,處理細胞比處理細胞核要簡單得多。從細胞中獲取細胞核至少需要兩個步驟:裂解和離心。人們通常利用去垢劑裂解細胞,并用Dounce勻漿器均質(zhì)化。之后通過流式細胞儀或梯度離心法純化出細胞核。
然而,單細胞測序的準備過程往往是造成實驗可變性的主要因素。如何獲得足質(zhì)足量的單細胞懸液,這是人們面臨的第一個難題,特別是那些稀有細胞或難以解離的細胞。
對各種組織而言,細胞外基質(zhì)組分不同,這使得單細胞制備的方式也有所不同。人們需要對細胞解離的操作方案進行個性化的優(yōu)化。
樣品制備過程涉及到組織收集、研磨/均質(zhì)化、酶促解離以及稀有細胞的富集。每一步都可能影響RNA含量,也不能準確地反映細胞類型的真實比例。解離操作往往使樣品偏向于一種或幾種細胞,從而錯過其他更值得關(guān)注的細胞。
于是,科學(xué)家和生產(chǎn)商開始引入一些工具和方法,希望盡量減少單細胞研究中的偏倚。加州大學(xué)歐文分校的一個研究團隊開發(fā)出一種微流體裝置,這一裝置利用流動限制來產(chǎn)生高剪切力的區(qū)域,從而將細胞與基質(zhì)分離開,使其適用于單細胞分析。美天旎也提供gentleMACS組織處理器及各類組織解離試劑盒,能夠高效、穩(wěn)定地處理各類樣本,獲得高活力的單細胞懸液。
哪種方法更好:細胞還是細胞核?
人們不禁會問,細胞核轉(zhuǎn)錄組是否代表了整個細胞的轉(zhuǎn)錄組,以及在snRNA-seq中發(fā)現(xiàn)的基因是否或多或少與特定研究相關(guān)。一些比較單細胞RNA測序(scRNA-seq)和單核RNA測序的研究表明,轉(zhuǎn)錄本在整個細胞和細胞核中的表達程度相當(dāng)。
華盛頓大學(xué)(圣路易斯)的一個研究小組近將單細胞測序(DropSeq)與單細胞核測序(sNuc-DropSeq)進行比較。他們研究的對象是纖維化成年小鼠腎臟。通過分析DropSeq獲得的11,000個轉(zhuǎn)錄組,研究人員發(fā)現(xiàn)腎小球細胞不存在,并且另一組細胞似乎經(jīng)歷了解離誘導(dǎo)的應(yīng)激。相比之下,單核RNA測序揭示了腎細胞的完整多樣性。
這些研究人員的結(jié)論是,盡管在細胞類型覆蓋度方面具有可比性,但單核RNA測序的優(yōu)勢在于“減少了解離偏倚,與冷凍樣品兼容,避免了解離引起的轉(zhuǎn)錄應(yīng)激反應(yīng)以及在纖維化腎臟上有著出色的表現(xiàn)”。
單核RNA測序技術(shù)
2017年,Broad研究所張鋒和Aviv Regev領(lǐng)導(dǎo)的團隊開發(fā)出一種名為DroNc-Seq的單細胞核測序方法。它受到Drop-Seq方法的啟發(fā),融合sNuc-Seq和微流體技術(shù),能夠?qū)Υ竽X等復(fù)雜組織進行大規(guī)模的并行分析。
DroNc-Seq方法消除了解離偏倚的問題,適用于固定組織或不容易解離的細胞。同時,與sNuc-Seq相比,它的實驗規(guī)模大大擴大,可加速表達譜分析,并降低實驗成本。在此基礎(chǔ)上,Dolomite Bio公司開發(fā)出了Nadia高通量單細胞建庫儀。
此外,加州大學(xué)圣地亞哥分校的張鹍教授團隊也在2017年開發(fā)出基于微流體的單核RNA測序技術(shù)——snDrop-seq。這種技術(shù)攻克了在微滴中有效裂解核膜而不引起RNA過度降解的難題,可以對成千上萬個單細胞同時進行轉(zhuǎn)錄組分析,還可用來評估新鮮和凍存組織的特異性表達譜,有助于研究組織的功能異質(zhì)性。
單核RNA測序通過揭示復(fù)雜腫瘤的細胞類型、狀態(tài)、遺傳多樣性和相互作用,拓寬了單細胞研究的能力,特別是長期保存或冷凍保存的樣品。它克服了解離偏倚的問題,也適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織。不過,細胞核的mRNA含量要低得多,而細胞核與細胞RNA表達是否重疊,這也是研究機構(gòu)一直在解決的問題。
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