RIPA 裂解液用于樣品總蛋白提取已經(jīng)有三十多年的時(shí)間，但是他到底適不適合你的下游實(shí)驗(yàn)，這個(gè)事你考慮過嗎？比如 RIPA 提到的蛋白圖譜是否完整？ 和其他方法對比提取的蛋白有哪些差異？使用時(shí)有沒有潛在問題？一句話：RIPA 到底靠不靠譜？

    研究方法

    分別使用 RIPA 和 2%SDS+超聲提取未激活 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細(xì)胞提取總蛋白

    WB 進(jìn)行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 活性檢測

    主要發(fā)現(xiàn)

    p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時(shí)會人工激活 caspase-3 and caspase-7。

    劃重點(diǎn)：細(xì)胞凋亡研究時(shí)要慎用 RIPA

    1、 研究方法

    培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞分別使用 RIPA 和 NP-40 提取

    用特異性單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀

    使用同樣量 pp60-src 沉淀蛋白進(jìn)行激酶檢測

    主要發(fā)現(xiàn)

    使用 RIPA 提取蛋白，激酶活性比 NP-40 提取高了七倍

    RIPA buffer 人工增加激酶活性

    劃重點(diǎn)：激酶活性檢測時(shí)要慎用 RIPA

    2、 研究方法

    研究使用化學(xué)誘導(dǎo)和無誘導(dǎo)的人細(xì)胞系，總蛋白分別使用 RIPA 和柱式法蛋白提取

    蛋白通過 SDS-PAGE 分離，進(jìn)行 WB 檢測磷酸化蛋白的對比

    NT=細(xì)胞沒有通過化學(xué)處理激活（基線水平），T=細(xì)胞通過化學(xué)激活處理。化學(xué)激活后，磷酸化蛋白（P）預(yù)期應(yīng)比基線水平（NT）增加，非磷酸化蛋白（np）減少。

    3、主要發(fā)現(xiàn)

    通過 actin 條帶強(qiáng)度可以證明蛋白樣品是等量上樣

    STAT3 在兩種提取方法中顯示了同樣的趨勢

    P56 在兩種提取方法中卻顯示明顯的不同

    離心管柱法提取蛋白獲得了預(yù)期的結(jié)果，但是 RIPA 獲得了*相反的結(jié)果

    4、研究方法

    野生型和突變型乳-腺上皮細(xì)胞通過 RIPA 裂解液裂解，通過離心獲取 RIPA 可溶性和不可溶性組份

    RIPA 不可溶性組份用 SDS-PAGE 樣品緩沖液溶解，使用多種抗體進(jìn)行驗(yàn)證

    5、主要發(fā)現(xiàn)

    RIPA 不可溶性組份中有明顯的蛋白丟失情況

    野生型和突變型樣品均有丟失蛋白，包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白（pY-416c-Src）

    劃重點(diǎn)：在某些蛋白質(zhì)磷酸化研究中慎用 RIPA

    6、研究方法

    使用 RIPA buffer 提取乳-腺癌組織中總蛋白

    RIPA 方法提取丟棄的不可溶性組份通過尿素裂解液再次提取蛋白

    通過質(zhì)譜分析兩部分蛋白質(zhì)圖譜

    7、主要發(fā)現(xiàn)

    RIPA buffer 提取后不可溶性組份中含有很多種蛋白

    幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白都存在于不溶性組分中

    不溶性組分中蛋白質(zhì)的分子量平均高出 60%

    RIPA 在 4 種乳-腺癌樣品提取中都產(chǎn)生了明顯的蛋白丟失，主要是高分子量蛋白

    劃重點(diǎn)：細(xì)胞外基質(zhì)研究時(shí)慎用 RIPA

    8、研究方法

    小鼠組織樣品分別使用離心管柱法和 RIPA buffer 提取總蛋白

    RIPA 提取后不可溶組份進(jìn)一步使用離心管柱法進(jìn)行提取

    提取后的蛋白通過 SDS-PAGE 分離，考染進(jìn)行對比

    9、主要發(fā)現(xiàn)

    RIPA 不可溶組份仍可以提取出蛋白，分子量從小于 20KD 到大于 120KD 范圍，證明 RIPA 提蛋白有丟失

    -明顯的區(qū)域是低分子量蛋白

    蛋白丟失是具有選擇性，且不成比例的

    不同的樣品間蛋白丟失的圖譜是不同的

    劃重點(diǎn)：定量，定性蛋白研究慎用 RIPA

    What？看完一臉懵 X 嗎？用了這么久的 RIPA 居然有這么多慎用，這也太不靠譜了，那該怎么辦？

    如果正在做以上實(shí)驗(yàn)研究遇到問題，那么務(wù)必要使用不同提取蛋白的方法來驗(yàn)證結(jié)果！