間接ELISA中試劑的配制及反應(yīng)流程實驗概要

　　間接ELISA是一種很實用而常用的免疫分析方法，本文將對反應(yīng)中所用到的試劑的配制方法和反應(yīng)的流程進行闡述。

　　主要試劑

　　1. 包被緩沖液：(0.05 mol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)

　　Na2CO3 1.59g

　　NaHCO3 2.93g

　　蒸餾水 1000ml

　　4℃保存，一周內(nèi)用完。

　　2. 磷酸鹽緩沖液(PBS，PH 7.4)

　　NaCl 8.0g

　　KH2PO4 0.2g

　　KCl 0.2g

　　Na2HPO4.12H2O 3.65g

　　蒸餾水 1000ml

　　3. 洗滌液(0.01 mol/L，pH7.4的PBST)

　　1L PBS中加入0.5ml Tween-20

　　4. 封閉液(5% 脫脂奶粉)

　　5g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。

　　5. 一抗及二抗稀釋液(2% 脫脂奶粉)

　　2g 脫脂奶粉加入100ml PBS緩沖液中。

　　6. 配制顯色液所需試劑：

　　1) 0.1M 檸檬酸(1.05g檸檬酸 50ml雙蒸水)

　　2) 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.1628g Na2HPO4.12H2O 100 ml雙蒸水)

　　3) 1% TMB (10mgTMB 200μl無水乙醇 800μl水)

　　這三種溶液均須現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　7. 顯色液：

　　分別取A液 24.3ml，B液25.7ml，混合后加入50ml 雙蒸水。然后從中取出9.9ml移入新試管中，再加入100μl C液，最后加入10μl 30% H2O2。

　　注意：30% H2O2溶液應(yīng)避光保存。C液和H2O2溶液最好在臨用前加入。

　　8. 終止液(2M的H2SO4)

　　11 ml濃硫酸 89ml水

　　實驗步驟

　　1. 包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度(如2μg/ml)，每孔加入100μl稀釋好的抗原，于4℃下過夜。

　　2. 洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，每次5分鐘。洗滌時將板子放在96孔板振蕩器上，600轉(zhuǎn)/分鐘。

　　3. 封閉：每孔加入300μl封閉液，放于濕盒中，37℃，孵育2h。注意要將濕盒提前放入37℃溫箱中預(yù)熱。

　　4. 洗滌：同步驟2。

　　5. 加一抗，即被檢血清：每孔加入用一抗稀釋液稀釋好的被檢血清100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。注意設(shè)置陽性和陰性對照。

　　6. 洗滌：洗滌方式同步驟2，次數(shù)為4次。

　　7. 加酶標二抗：按商品化酶標二抗的推薦濃度或者預(yù)實驗中較好的濃度稀釋二抗，每孔加100μl，放于濕盒中，37℃，孵育1h。

　　8. 洗滌：同步驟6。

　　9. 加顯色液：每孔加100μl顯色液，避光反應(yīng)15分鐘。

　　10. 終止：每孔加入50μl終止液。

　　11. 讀數(shù)：將ELISA反應(yīng)板放入酶標儀中，讀取OD值。注意酶標儀應(yīng)提前15分鐘打開預(yù)熱，還有讀數(shù)前最好用酒精棉球擦拭反應(yīng)板底部，以除去指痕等污漬。

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