技術(shù)資料：熒光素標(biāo)記抗體的方法

　　(一)FITC標(biāo)記抗體的方法

　　1.Marsshall 氏法

　　(1)材料：抗體球蛋白溶液、0.5mol/l pH9.0碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光素、1%硫柳汞水溶液、三角燒瓶(25～50ml)、冰及冰槽(或1000ml燒杯)、電磁攪拌器、滅菌吸管、透析袋、玻棒、棉線及燒杯(500ml)、pH7.2或8.0的0.01mol/L PBS等。

　　(2)方法及步驟：

　　①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使zui后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌(速度適當(dāng)以不起泡沫為宜)5～10min。

　　②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg 熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。

　　③結(jié)合(或稱標(biāo)記)：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上(大約5～10min內(nèi)加完)，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水;亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。

　　④透析：結(jié)合完畢后，將球蛋白的溶液離心(2500r/min)20min，除去其中少量之沉淀物，裝入透析袋中后再置于燒杯中，用pH8.0緩沖鹽水透析(0～4℃)過夜。

　　⑤過柱：取透析過夜的標(biāo)記物，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光抗體進(jìn)行鑒定(圖3-11，圖-3-12)。

　　FITC與家兔IgG球蛋白在25℃和2℃時結(jié)合的動力學(xué)(Kawamura 1964)

　　洗脫液：0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.2);過濾量:12ml標(biāo)記蛋白液(過濾前未透析);收集量:20ml(稀釋1.7倍)。

　　分別以1mgFITC溶于2份1mol 0.5mol/L碳酸重碳酸鹽緩沖液(分別為pH9.5和pH9.0)，于2℃下攪拌將其各加入100mg家兔IgG生理鹽水溶液中，攪勻后立即將每份分為兩半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。間隔一定時間后各取出0.5ml通過sephadex G-25去游離FITC，由上計算出5mg家兔IgG結(jié)合的FITC量。

　　2.Chadwick 氏法

　　(1)材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、三角燒瓶(25ml)、冰槽、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯(500ml)、透析袋、棉線、玻棒等。

　　(2)方法及步驟：

　　①抗體準(zhǔn)備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶內(nèi)，放于冰槽中。

　　②熒光色素準(zhǔn)備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。

　　③將準(zhǔn)備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭颍?～4℃，冰箱中結(jié)合18～24h。

　　④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。

　　3.改良法(1963年) 　根據(jù)Marshall 氏法取高價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0.15mol/l NaCl)及緩沖液(0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，(蛋白：熒光素=50～80mg:1mg)，在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler氏試劑測驗(yàn)至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，-20℃保存可達(dá)2年以上。

　　【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。

　　【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。

　　【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。

　　4.透析標(biāo)記法　　 此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡便，非特異性染色較少。

　　(1)用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。

　　(2)用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中(圖3-13)。

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