Elisa實驗：細胞凋亡檢測操作步驟之ELISA法

　　細胞凋亡發生時，內源性核酸內切酶將分解核小體區間的雙鏈DNA，但核小體本身由于由組蛋白緊密結合而免受切割，單克隆抗體可以與核小體形成夾心結構，可通過檢測核小體判斷細胞是否經歷凋亡事件。

　　(一) 原理

　　細胞凋亡的發生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進入核小體間切割DNA,產生180bp～200bp或其倍數的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復合物而不被核酸內切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結構，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體片段。

　　(二)材料與試劑

　　1.采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標記的小鼠抗組蛋白單克隆抗

　　體。

　　2.過氧化物酶(-POD)標記的小鼠抗DNA單克隆抗體

　　3.鏈霉親合素包被的微孔板

　　4.DNA-組蛋白復合物，作為陰性對照。

　　5.ABTS底物

　　6.溶解緩沖液

　　7.溫育緩沖液

　　8.底物緩沖液

　　(三)樣品

　　1.培養細胞或離體細胞的裂解物細胞裂解步驟：收集細胞，離心后，用200µl溶細胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。

　　2.培養細胞的上清液

　　3.血漿(血清)

　　(四)操作方法

　　1.取樣品離心后(1 000r/min,10min),吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養板孔中。

　　2.另加入80µl免疫反應試劑含抗-DNA-POD、抗組蛋白-生物s及溫育緩沖液(按1︰1︰18混合)，室溫下孵育2h(置搖床上，250r/min)。

　　3.取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。

　　4.加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合(置搖床上)。

　　5.盡快作比色分析(10min～20min內)，用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進行檢測。

　　(五)結果判定

　　按下列公式計算細胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：

　　注：mU=吸收值(10-3)=雙孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應適當稀釋后再檢測。

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