多重熒光染色試劑盒—五色石蠟切片試劑盒

　　原理介紹:酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規免疫組化的DAB顯色方法，TSA技術同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應的“顯色"步驟(HRP催化加入反應體系的酪胺熒光素底物，產生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合，使樣品上穩定的共價結合酪胺熒光素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結合位點)，產生大量的酶促產物，該產物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、組氨s和酪氨s殘基)結合，這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積，結果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯熒光素)，來催化后續添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與熒光素穩定結合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的熒光素穩定共價結合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，熒光素都結合好后，后去檢測結果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數大大增強。

　　本公司開發的試劑盒具體酪胺熒光染料為一下其中一種或者多種：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現單標、雙標、三標以及多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內涵。

　　試劑盒組成：TYR-520熒光染料(綠光)(即用型，5mL),-20℃;TYR-570熒光染料(紅光)(即用型，5mL)，-20℃;TYR-620熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;TYR-690熒光染料(即用型，5mL)，-20℃;TSA+增強劑，100ul，-20℃(可選);高敏多聚hrp山羊抗兔二抗(10mL)4℃。

　　備注：TYR-520熒光染料、TYR-570熒光染料、TYR-620熒光染料、TYR-690熒光染料在-20度下，均為固體，使用之前需解凍。

　　TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據具體的情況選擇添加或者不選擇添加。

　　五色多重免疫熒光試劑盒操作流程：

　　1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二j苯Ⅰ15min-二j苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ。取出放在通風廚內，酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。

　　2、抗原修復：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內進行抗原修復(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min，停火8min，轉中低火7min，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據組織類型以及抗原類型來確定)。

　　3、阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫r液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　4、BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。

　　5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內加少量水防止抗體蒸發)

　　6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。

　　7、熒光染料反應：TYRXXX熒光染料反應10-15min，PBS洗三次。

　　8、重復2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)

　　9、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。

　　10、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

　　11、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統下觀察并采集圖像。

　　染料激發波長發射波長

　　DAPI藍色350 420

　　TYR-480 450 480

　　TYR-520綠色490 520

　　TYR-570紅色550 570

　　TYR-620 590 620

　　TYR-690 630 690

　　TYR-780 750 780文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A,B，C and D was performed using a Five-color Fluorescence kit(GuduoBio Biological Technology,Shanghai,China)based on the tyramide signal amplification(TSA)technology according to the manufacture’s instruction.

　　多重熒光染色試劑盒—五色石蠟切片試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。