純化線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

　　主要用途

　　純化線粒體膜通道孔(MPTP)熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過鈣黃綠素載入后離心處理或鈷淬滅技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到線粒體外的熒光染料，即刻發(fā)生熒光去除或淬滅，來分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膜通道孔活性(瞬時(shí)或開放狀態(tài))的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

　　技術(shù)背景

　　線粒體膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore;MPTP)是由線粒體內(nèi)外膜成分構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞ssc 的釋放和線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素-AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素-乙酰氧基甲基酯【bis(bis-carboxymethyl amino methyl fluorescein)-acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：第一，適宜的分子量622kd，小于1.5kd;第二，幾乎不具有膜結(jié)合性;第三，不是線粒體酶的底物;第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM 進(jìn)入線粒體后，被內(nèi)酯酶切離，產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素，被線粒體俘獲。同時(shí)線粒體外的鈣黃綠素通過離心去除或受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放，鈣黃綠素釋放出線粒體外，由于離心處理或被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓砻髂ねǖ揽椎拈_放狀態(tài)。

　　產(chǎn)品內(nèi)容

　　染色液(Reagent A) X 微升

　　中和液(Reagent B) X 毫升

　　保存液(Reagent C) X 毫升

　　說明書1 份

　　保存方式

　　保存染色液(Reagent A)在-20℃冰箱里，避免光照;其余的保存在4℃冰箱里;有效保證

　　6 個(gè)月

　　用戶自備

　　96 孔酶標(biāo)板：用于線粒體熒光分析的容器

　　1.5 毫升離心管：用于線粒體染色的容器

　　載波片/蓋玻片：用于線粒體樣品存放后熒光分析

　　微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀線粒體

　　培養(yǎng)箱：用于染色孵育

　　(共聚焦)熒光顯微鏡：用于線粒體熒光分析

　　熒光分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于線粒體熒光定量分析

　　實(shí)驗(yàn)步驟

　　一、直接法

　　1. 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品

　　2. 移取100 微升線粒體樣品(總量為2 毫克)到1.5 毫升離心管

　　3. 加入X 微升染色液(Reagent A)，混勻

　　4. 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘，避免光照

　　5. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g(或13000RPM，例如eppendorf

　　5415)

　　6. 小心抽去上清液

　　7. 加入X 微升37℃預(yù)熱的保存液(Reagent C)，混勻顆粒群

　　8. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g(或13000RPM，例如eppendorf5415)

　　9. 小心抽去保存液(Reagent C)

　　10.小心加入X 微升37℃預(yù)熱的保存液(Reagent C)，混勻顆粒群

　　11. 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

　　(A)使用(共聚焦)熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè))：

　　1)移取10 微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

　　2)激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)

　　(B) 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)(定量檢測(cè))：

　　1)移取100 微升上述懸液到100 微升比色杯或96 孔酶標(biāo)板

　　2)即刻放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)

　　二、間接法

　　實(shí)驗(yàn)開始前，將-20℃冰箱里的試劑盒中的染色液(Reagent A)置入冰槽里融化，中和液(Reagent B)放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10 微升染色液(Reagent A)到新的1.5毫升離心管，加入100 微升中和液(Reagent B)，混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。

　　然后進(jìn)行下列操作。

　　1. 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品

　　2. 移取100 微升線粒體樣品(總量為2 毫克)到1.5 毫升離心管

　　3. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g(或13000RPM，例如eppendorf5415)

　　4. 小心抽去上清液

　　5. 加入X 微升含有染色液(Reagent A)和中和液(Reagent B)的染色工作液，充分混勻

　　6. 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘，避免光照

　　7. 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

　　a) 使用(共聚焦)熒光顯微鏡觀察(定性檢測(cè))：

　　1)移取10 微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片(每隔5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30 分鐘)

　　2)激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)

　　b) 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)(定量檢測(cè))：

　　1) 移取100 微升上述懸液到100 微升比色杯或96 孔酶標(biāo)板

　　2) 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀(每隔5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30 分鐘)：激發(fā)波長488nm，散發(fā)波長505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性(MPTP)增強(qiáng)

　　注意事項(xiàng)

　　1. 本產(chǎn)品為20 次操作

　　2. 操作時(shí)，須戴手套

　　3. 染色前，所有試劑溶液，除染色液(Reagent A)外，需37℃預(yù)熱

　　4. 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析

　　5. 孵育時(shí)，必須避免光照

　　6. 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色

　　7. 如果不具備505nm 散發(fā)波長的濾波器，可以使用505nm 至530nm 中的任一波長

　　8. 如果膜通道孔為瞬時(shí)開放(transient)，則熒光緩慢且自發(fā)降低

　　9. 本公司提供膜通道孔抑制劑：0.2 毫摩爾環(huán)胞素A(cyclosporine A)，維護(hù)熒光完整

　　10.本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

　　質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

　　1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

　　2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰

　　熒光檢測(cè)試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒