苦參堿誘導胃細胞自噬和凋亡測試報價低

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苦參堿誘導胃細胞自噬和凋亡測試報價低相關(guān)文獻：

苦參堿是從傳統(tǒng)中藥苦參中提取的一種生物堿,具有的藥理作用。本實驗的目的是研究苦參堿對胃SGC-7901細胞的作用,闡明自噬和凋亡在苦參堿胃過程中的作用,并進一步證明苦參堿誘導細胞自噬發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導通路,為中藥單體及聯(lián)合用藥胃提供實驗依據(jù)。 方法 用SRB法檢測細胞活力,流式細胞術(shù)檢測苦參堿對細胞周期的影響。Annexin-V-FITC/PI雙染檢測不同濃度苦參堿對細胞凋亡的誘導作用。用倒置相差顯微鏡觀察苦參堿干預后SGC-7901細胞的形態(tài)學改變,并用透射電鏡進一步觀察細胞的微結(jié)構(gòu)變化。同時用MDC染色后通過熒光顯微鏡鑒定自噬的發(fā)生。應用western blot檢測自噬分子標記物LC3表達水平,從分子生物學水平檢測細胞自噬水平的改變。用自噬劑、自噬誘導劑、凋亡劑分別聯(lián)合苦參堿干預胃細胞,調(diào)控苦參堿誘導的自噬和凋亡,用’PI染色檢測其對苦參堿誘導的胃細胞死亡率的影響,后用western blot檢測PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號通路的相關(guān)分子是否參與苦參堿誘導的自噬過程,并用實時定量RT-PCR檢測促凋亡基因Bax和自噬相關(guān)基因Beclin1的mRNA表達水平。 結(jié)果 苦參堿能SGC-7901,呈時間劑量依賴性,并將SGC-7901細胞阻滯在細胞周期的G0/G1期。Annexin-V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示苦參堿以劑量依賴性誘導細胞凋亡,與對照組相比,當用0.5、1.0和2.0mg/ml的苦參堿處理SGC-7901細胞后,凋亡率分別上升72.92±3.41%、77.75±2.19%和83.28±2.75%。倒置相差顯微鏡觀察到苦參堿干預后的細胞形態(tài)學改變,在細胞質(zhì)中可見大量的大小不等的空泡,而且隨著苦參堿濃度的增加胞質(zhì)中的空泡逐漸增大增多。透射電鏡進一步苦參堿干預后的SGC-7901細胞內(nèi)有大量自噬泡形成。MDC染色熒光顯微鏡檢測可見苦參堿組比未處理組顯示更強的熒光信號和更多的MDC標記顆粒(?)Western blot結(jié)果顯示苦參堿誘導胃細胞LC3-Ⅱ表達水平以時間和劑量依賴性增加,并且為苦參堿細胞自噬活性而非自噬體降解所導致的LC3-Ⅱ。PI染色流式細胞儀檢測顯示細胞死亡率隨著苦參堿濃度的增加而,用自噬劑3-MA或巴弗洛霉素A1聯(lián)合干預后,苦參堿誘導的細胞死亡率進一步增加,并且在透射電鏡下可見到部分苦參堿干預細胞出現(xiàn)的凋亡形態(tài)學改變并且細胞內(nèi)自噬泡減少,Annexin-V-FITC/PI雙染結(jié)果進一步自噬能增加苦參堿誘導的凋亡,并且自噬劑能增加苦參堿對胃的作用。用caspase劑或自噬誘導劑聯(lián)合干預降低了苦參堿誘導的細胞死亡率。Western blot檢測結(jié)果顯示苦參堿干預后,盡管總Akt和總mTOR表達水平輕度降低,但Akt (Ser473)磷酸化水平以時間和劑量依賴性,其下游效應分子mTOR (Ser2448)和p70S6K (Thr389)的磷酸化水平也輕度。實時定量RT-PCR顯示苦參堿上調(diào)促凋亡基因Bax和自噬基因Beclin1的mRNA表達水平。 結(jié)論 苦參堿對胃具有的抗活性,而且苦參堿誘導胃細胞死亡時凋亡和自噬均被。自噬是胃細胞的適應性反應,了細胞存活,自噬能夠苦參堿誘導的細胞凋亡,因此聯(lián)合自噬劑是進一步苦參堿抗作用的策略。另外,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號通路可能未參與苦參堿誘導的自噬過程。

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