如何實施非洲豬瘟熒光定量PCR檢測：實驗室操作與技巧@2024全國包郵BK-PCR08，山東博科儀器廠家介紹，非洲豬瘟(ASF)的熒光定量PCR(qPCR)檢測是一種高靈敏度、高特異性的檢測方法，用于準確檢測非洲豬瘟病毒(ASFV)在樣本中的存在。這種方法能夠在病毒量很少的情況下進行定量分析，幫助及時發現和控制疫情。以下是實施非洲豬瘟熒光定量PCR檢測的詳細實驗室操作步驟與技巧：

　　1. 實驗準備

　　1.1 設備與試劑

　　PCR儀：用于進行熒光定量PCR反應。

　　離心機：用于樣本混勻和分離。

　　冰箱/冷凍柜：儲存試劑和樣本。

　　超凈工作臺：用于準備樣品和試劑，防止污染。

　　試劑：包括qPCR反應混合液、特異性引物、探針、Taq酶、dNTPs和緩沖液等。

　　1.2 實驗室環境

　　清潔：確保實驗室環境清潔，無污染源。

　　個人防護：佩戴實驗室衣物、手套和口罩，避免污染樣本和試劑。

　　2. 樣本準備

　　2.1 樣本采集

　　樣本類型：可采用血液、組織或體液等樣本。

　　采集與保存：采集樣本后立即使用適當的保存液(如生理鹽水或含抗凝劑的液體)，并儲存在低溫條件下。

　　2.2 樣本處理

　　離心：將樣本離心，分離出上清液或沉淀。

　　提取核酸：使用商業化的核酸提取試劑盒或手工提取方法提取樣本中的DNA。確保提取的DNA不含污染物。

　　3. qPCR反應設置

　　3.1 反應體系準備

　　反應混合液：準備熒光定量PCR反應混合液，包括qPCR緩沖液、Taq酶、熒光探針、引物、dNTPs等。通常按照試劑盒說明書的推薦比例配制。

　　引物和探針：設計針對ASFV的特異性引物和探針。確保探針帶有熒光標記，用于實時監測PCR反應。

　　3.2 反應體系配置

　　在超凈工作臺中，將反應混合液按照預定配方加入PCR反應管中。

　　加入提取的DNA樣本。

　　避免反應體系中的氣泡，輕輕混勻。

　　3.3 樣本和對照

　　標準品：使用已知濃度的ASFV標準品進行定量校準。

　　陰性對照：加入無病毒樣本，檢查是否存在交叉污染。

　　陽性對照：加入已知含ASFV的樣本，驗證反應體系的有效性。

　　4. qPCR反應程序

　　4.1 設置PCR儀

　　程序設置：根據試劑盒說明書設置PCR儀的程序，包括變性、退火和擴增階段的溫度和時間。典型的程序包括初步變性(95°C，3-5分鐘)、循環(95°C，30秒;60°C，30秒;72°C，30秒)，通常進行40個循環。

　　熒光檢測：在每個擴增循環結束時，PCR儀會自動記錄熒光信號。

　　4.2 運行與數據分析

　　運行PCR程序：將PCR管放入儀器中，啟動程序。

　　數據分析：使用PCR儀提供的軟件分析數據。通過對照標準曲線計算樣本中ASFV的拷貝數。

　　5. 實驗結果解讀

　　5.1 數據解讀

　　Ct值：熒光閾值循環數(Ct值)與樣本中病毒量成反比。較低的Ct值表示樣本中病毒量較高。

　　標準曲線：根據標準品建立的標準曲線，計算樣本中ASFV的拷貝數。

　　5.2 結果驗證

　　重復檢測：建議對可疑結果進行重復檢測以提高結果的可靠性。

　　結果記錄：詳細記錄每次實驗的結果，并保存數據以備查驗。

　　6. 實驗室操作技巧

　　防止污染：嚴格分開樣本處理區和反應混合液配置區，使用不同的移液器頭。

　　操作規范：保持實驗室操作的規范性，定期校準設備，確保結果的準確性。

　　培訓人員：確保實驗人員接受過專業培訓，熟悉操作步驟和技巧。

　　總結

　　實施非洲豬瘟熒光定量PCR檢測需要細致的樣本處理、準確的反應體系配置、嚴格的操作規范以及科學的數據分析。通過規范化的操作和技巧，可以有效提高檢測的靈敏度和準確性，為非洲豬瘟的早期發現和控制提供可靠的數據支持。