PK-15細胞低血清培養：

一、 PK-15細胞的特點及用途

1. PK-15系豬腎細胞（pig kidney），體外培養呈上皮樣貼壁型細胞；

2.該細胞對多種病毒比較敏感，如豬圓環病毒（PCV）、豬細小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）等，可應用于豬圓環病毒疫苗、豬細小病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗等的制備。

3.目前培養PK-15細胞生產疫苗的主要是轉瓶工藝，培養基為基礎培養基DMEM、199或MEM+10%小牛血清。

4.該細胞較易適應低血清培養，并有不同的克隆，血清使用量可降低至3-5%。

二、PK-15細胞低血清培養

1、細胞形態

在方瓶中使用低血清培養基（MD611）逐代降低血清使用量，進行細胞的低血清馴化適應，在低血清培養狀態下，細胞具有清晰的輪廓、立體感較強，細胞更致密，與原培養液的細胞形態無差異。

2、細胞增殖情況

PK-15細胞以一定接種密度（3-4×104個/cm2）接種方瓶進行連續傳代，3d左右細胞可形成單層或致密單層，需及時傳代。如下圖所示，使用低血清培養基+5%NBS培養的細胞與DMEM+10%NBS培養的增殖速率基本無差別，細胞3d可增殖6-7倍，細胞數可達2×107個/T75。

三、低血清培養PK-15細胞的探討

1.細胞在改變培養環境時，如改換培養基、血清，包括血清批號、血清廠家、血清濃度等，細胞的培養情況可能會與先前培養的經驗有所差異，此時應注意細胞的傳代比例、分種時間等，應根據細胞的生長情況進行調節。比如細胞在改變初期pH變化可能較快，應及時對細胞進行換液培養，PK-15細胞培養液pH一般不應低于6.8；

2.低血清培養基營養成分豐富，PK-15細胞代謝旺盛，因此在使用低血清培養基時需按照產品說明加入標示量的碳酸氫鈉以維持適當的pH及滲透壓，有利于細胞的生長、增殖；

3. PK-15細胞在低血清培養基中比較容易適應培養，血清量可間接或直接進行降低。本實驗室做過10%、7%、5%血清的逐代降低，細胞按照4×104/cm2密度接種，3d進行傳代，細胞可良好適應。

四、MD611低血清培養基的配制方法

MD611培養基不同于傳統的培養基，培養基的正確配制和使用方法影響細胞的培養效果，應嚴格按使用說明書配制使用。以50L/包規格低血清培養基為例，應按以下程序配制培養基。

1.打開培養基包裝，將培養基全部倒入一容器中。

2.用少量冷卻注射用水（20℃～30℃）涮洗袋內殘留培養基，倒入容器內。

3.向容器中加入約40L冷卻注射用水（20℃～30℃），攪拌至培養基*溶解。

4.按使用說明書標示量加入114.5克碳酸氫鈉，攪拌至*溶解，補加冷卻注射用水（20℃～30℃）至50L，充分混合，用pH計檢測，溶液pH應為7.2～7.4。

5.按使用量加入血清和抗生素，混合均勻，用0.22μm濾膜正壓過濾除菌。

6.除菌后培養基，置2℃～8℃避光保存。

五、MD611低血清培養基一些注意事項

1.不可配制成濃縮液儲存使用。

2.不可用高壓濕熱法進行滅菌。

3.不可冷凍儲存，再溶解使用。

4.不可常溫儲存，2～8℃儲存。

5.該培養基中已含谷氨酰胺，由于谷氨酰胺不穩定，易分解，產生對細胞敏感的毒性物質，故加入血清的*培養液應盡快使用完畢。

6.該培養基中所含指示劑酚紅的量是常規量的一半，故從外觀上看所配溶液顏色較淺，判定pH時，建議用pH計測定pH。