實驗目的
掌握凝膠層析的基本原理。
學習利用凝膠層析法測定蛋白質相對分子質量的實驗技能。
實驗原理
凝膠層析法也稱分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術。當混合物隨流動相經過凝膠層析柱時，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術。該法設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高。

凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網狀結構、呈珠狀顆粒的物質，每個顆粒的細微結構及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進入凝膠網孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當含有分子大小不一的蛋白質混合物樣品加到用此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時，這些物質即隨洗脫液的流動而發生移動。大分子物質沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動，流程短，移動速率快，先被洗出層析柱；而小分子物質可通過凝膠網孔進入顆粒內部，然后再擴散出來，故流程長，移動速度慢，zui后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述*排阻或*滲入凝膠的物質，則居二者之間從柱中流出。總之，各種不同相對分子質量的蛋白質分子，zui終由于它們被排阻和擴散的程度不同，在凝膠柱中所經過的路程和時間也不同，從而彼此可以分離開來。

如果假定蛋白質分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質，在洗脫時峰的位置和該物質相對分子質量有直接的定量的關系。在一根凝膠柱中，凝膠顆粒間空隙所含水相體積為外水體積VＯ，不能進入凝膠孔徑的那些大分子，當洗脫體積為時VＯ，出現洗脫峰。
凝膠顆粒內部孔穴的總體積為內水體積Vi，能全部滲入凝膠的那些小分子，當洗脫體積為VＯ+Vi時，出現洗脫峰。
利用Andrews的實驗經驗式：
lgMr = a/b—Ve/bVo
式中，Ve為洗脫體積。它是自加樣品開始到該組分的洗脫峰（峰頂）出現時所流出的體積。Vo為外水體積，Mr為相對分子質量，a和b為常數。
葡聚糖凝膠有不同的型號，用于分離不同相對分子質量大小的物質。例如Sephardex G-75的分級范圍是3000-80000的球形分子。在本實驗中用于分離胰島素（Mr為6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。

儀器和試劑
儀器：層析柱、恒流泵、紫外檢測儀、自動部分收集器
試劑
待測樣品：胰島素、牛血清白蛋白
藍色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脫劑
實驗步驟
1．凝膠溶脹
凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩定，結果較好。
取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時間因凝膠交聯度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時，這樣可大大縮短溶脹時間，而且可以殺死細菌和霉菌，并可排出凝膠內氣泡。溶脹過程中注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細小顆粒，zui后凝膠經減壓抽氣除去氣泡，即可準備裝柱。

2. 裝柱與平衡
裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關閉出口，向柱管內加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調節合適的流速，使凝膠繼續沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口。裝柱要求連續、均勻、無氣泡、無“紋路”。
將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。

3. 上樣與洗脫
樣品上柱是實驗成敗的關鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會使區帶擴散，影響層析效果。上樣時應盡量保持床面的穩定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時，關閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計算流出體積，當樣品滲入床中接近床表面1mm時關閉出口。按加樣操作，用少量（約1ml）洗脫液沖洗管壁2次。zui后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3～5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進水口連通恒流泵，調好流速，以每管3ml/10min流速開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%；制備用量為柱床容積的20%~30%。

4. 收集與鑒定
用自動部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測儀280nm波長處檢測，zui高的一個OD值時的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5．凝膠柱的處理
凝膠用過后，反復用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長期用干燥狀態保存。
計算
分子量的測定和計算，一般都采用標準曲線法。只要測得幾種標準蛋白質相對分子質量的Ve，并以它們的相對分子質量的對數（logMr）對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對分子質量。
注意事項
各接頭不能漏氣，連續用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內的排氣管應無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內液面不斷下降，則表示整個系統有漏氣之處，應仔細檢查并加以糾正。
始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變壞，不得不重新裝柱。