免疫細胞（組織）化學實驗中如何選擇固定劑？
固定劑主要有兩類：一類是有機溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮等。它們通過強烈脫水變性蛋白，同時它們也能夠溶解脂類物質(zhì)，因此產(chǎn)生通透效應(yīng)。另一類為交聯(lián)劑，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它們導(dǎo)致細胞內(nèi)分子相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而維持在原位上。這兩類固定劑各有優(yōu)缺點，交聯(lián)劑比有機溶劑更易于保持細胞的結(jié)構(gòu)，但交聯(lián)可能會破壞一些細胞組分的抗原性。同時交聯(lián)劑固定的細胞需要通透處理，才能讓抗體穿越膜結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)抗原結(jié)合。醇類固定的優(yōu)勢在于蛋白變性*，對抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇類固定的細胞不需要再通透。
在免疫細胞（組織）化學實驗中選擇哪種固定方法，先要考慮所檢測抗原在細胞中的定位，通常膜組分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往憑經(jīng)驗選擇固定劑，可以試用兩種方法，然后選擇較好的一種。

免疫熒光，免疫細胞化學和免疫組織化學實驗如何設(shè)置對照？
設(shè)立對照的目的在于證明和肯定陽性結(jié)果的特異性，排除非特異性疑問，同時對照的設(shè)立也有助于判斷實驗中出現(xiàn)的問題。
（1）陰性對照
　　陰性對照可以了解背景熒光和非特異性染色，當待檢標本呈陽性結(jié)果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。較理想的陰性對照檢測遺傳背景相同但僅僅不表達所研究抗原的細胞，例如把某個蛋白已敲除的細胞或動物組織樣品。但這樣的標本不一定存在或很難找到，常見的陰性對照也可以是針對一抗的PBS對照或來自同一種屬動物的血清對照。
（2）陽性對照
用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，這種陽性對照可驗證Protocol，排除實驗過程中出現(xiàn)的差錯。另一種陽性對照可以是在細胞內(nèi)過表達所研究的抗原。同時也可以在這個抗原上接上商業(yè)化的表達標簽，如Flag, Myc, His tag等。
什么是免疫熒光雙標記，怎么進行熒光雙標實驗？
免疫熒光雙標記（Double Immunofluorescence）是用兩種不同熒光染料標記的抗體同時檢測兩種抗原。標記這兩種抗體的熒光素具有不同的顏色（激發(fā)和發(fā)射波長不同），通過熒光顯微鏡可以在同一細胞上分別觀察到兩種抗原，并可通過圖像處理軟件將它們同時呈現(xiàn)在一張圖片上。
由于在同一個樣本使用兩種染料，為此就要求每一種檢測試劑僅能識別一種抗原。主要有兩種方法能夠達到這一目的。zui確定的方法就是直接標記一抗，如其中一種標記FITC，另一種標記Texas紅，一般會有滿意的結(jié)果。第二種方法是應(yīng)用兩套種屬特異性的檢測試劑。在進行這類進行熒光雙標前，先驗證單標對特定組織或細胞是有效的。在操作上與單標方法并無不同，但兩種一抗必須來源于不同種屬的動物，且兩種二抗不能存在交叉反應(yīng)。

應(yīng)該選擇什么樣的抗體進行免疫熒光及免疫細胞（組織）化學實驗？
如果使用商業(yè)化的抗體，在使用之前要仔細閱讀公司關(guān)于抗體的說明，該抗體是否能用來做免疫熒光或免疫細胞（組織）化學實驗。對于自己生產(chǎn)的抗體，在生產(chǎn)抗體時選用的免疫原對獲得高質(zhì)量的試驗結(jié)果非常重要。
其次，就是單抗和多抗的選擇問題。這方面基本上遵循著通用的原則，多抗的優(yōu)點是來源動物種屬多，親和力高，反應(yīng)性廣，可以識別抗原的多種亞型，缺點是特異性相對較差，有時容易帶來假陽性結(jié)果，且抗體質(zhì)量存在批次差異；單抗的zui大優(yōu)點是特異性好，質(zhì)量穩(wěn)定，但缺點是動物來源受限（絕大多數(shù)是小鼠），靈敏度較低，而且價格較高。單抗對固定的容忍度不如多抗，因為它們識別的位點比較單一，更容易受到破壞。

免疫熒光實驗中用于標記抗體的熒光素有哪些，在選擇上有什么考慮？
以下列舉幾種常用的熒光素，更多的熒光素可以從相關(guān)上找到：
1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黃綠色熒光；
2. Rhodamine （TRITC） Excitation 552nm，Emission 570nm，橙紅色熒光；
3. R-Phycoerythrin （PE） Excitation 488nm，Emission 578nm，橙紅色熒光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，紅色熒光。
選擇熒光素主要考慮以下幾點：
①高消光系數(shù)（extinction coefficient）和光子產(chǎn)量（Quantum yield），這意味著光捕獲能力強和效率高；
②光穩(wěn)定性較好；
③與常見光源和濾光器匹配性較好；
④不干擾抗體反映；
⑤水溶性以及pH穩(wěn)定性。此外，還需要考慮到是否有毒性以及熒光素的顏色是否與背景顏色反差大對比鮮明等。

免疫酶標細胞（組織）化學中有哪些顯色液，它們的各自特性是什么？
免疫酶標細胞化學中，由于抗原-抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物本身無色，無法直接觀察，因而需借助于某些化學基團的呈色作用，使其得以顯示，以利于在顯微鏡下觀察。常用的顯色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯聯(lián)胺）顯色液
DAB顯色液主要用于免疫過氧化物酶法（如酶標法、PAP法等），是廣泛應(yīng)用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明，半*保存，且其終產(chǎn)物具嗜餓性，既可直接在光鏡下觀察，也可經(jīng)OsO4處理后，增加反應(yīng)產(chǎn)物的電子密度，適于電鏡下確定抗原存在的部位。但有幾點需注意：DAB溶解要*，否則未溶解的顆粒沉積于標本上影響觀察；DAB濃度不易過高，否則顯色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，應(yīng)盡量減少吸入和接觸次數(shù)，將DAB制成10倍貯存液，分裝于-20℃保存，應(yīng)用時稀釋、過濾。操作時應(yīng)戴手套，盡量避免與皮膚接觸，用后及時*沖洗，接觸DAB的實驗用品經(jīng)洗液浸泡24h后使用。
2．CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）顯色液
4-Cl-1-萘酚的終產(chǎn)物顯示藍色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚顯色的組織標本，勿用酒精脫水。與DAB比較，CN敏感性略差，但因其終產(chǎn)物較局限，很少彌散，光鏡觀察較為適合。
3．AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）顯色液
該顯色液作用后，陽性部分呈深紅色，加以蘇木精或亮綠等作為背景染色，則效果更佳。由于終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。AEC染色后的顏色比DAB好看，但是靈敏度比DAB低，而且保存時間短，易褪色。
4．TMB顯色液
TMB即四甲基聯(lián)苯胺（Tetrabenzidine）是一種脂溶性較強的基團，因此容易進入細胞與細胞器中的HRP反應(yīng)，且由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍色沉淀物，這使得TMB成為組化實驗中的一種很好的發(fā)色團。同時反應(yīng)產(chǎn)物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反應(yīng)進行。TMB的反應(yīng)產(chǎn)物為深藍色，利于光鏡觀察，且反應(yīng)產(chǎn)物越聚越大，常超出單個細胞器的范圍（而DAB則被限制在其內(nèi)），故TMB反應(yīng)的檢測閾較低。由于上述優(yōu)點，目前TMB常用于光鏡及超微結(jié)構(gòu)水平的HRP及HRP-WGA神經(jīng)投射的研究。需要注意的是：TMB顯色液中的A液和B液應(yīng)在2h內(nèi)新鮮配制。另外，TMB是一種較強的皮膚刺激劑，并有致癌的潛在可能，故使用時應(yīng)帶手套及在通風條件下操作。
5．BCIP/NBT顯色液
是堿性磷酸酶的顯色底物。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。NBT即四唑氮藍（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,為深藍色無定形微溶物質(zhì)。當二者存在時，在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被還原形成顯微鏡下可見的藍色或紫色沉淀。

有沒有辦法增強IF/ICC/IHC中的特異性染色，減少非特異性染色？
為了獲得高質(zhì)量的結(jié)果，在免疫染色中應(yīng)特別注意增強特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：
1．增強特異性染色的方法
　　（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以便抗體與抗原zui大限度的結(jié)合，增強特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細胞化學染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及鏈霉蛋白酶（pronase）等，也可用3mol/L尿素處理切片，達到酶消化的目的。酶消化的時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應(yīng)根據(jù)酶的活性通過預(yù)試驗確定，消化的時間還與組織固定的時間有關(guān)，一般是陳舊固定組織所需時間長，以37℃為宜，消化時間短的組織可在室溫中進行。消化處理時間過長能損傷組織，易使切片脫落，應(yīng)使用切片粘附劑，消化時間盡量縮短。
　　（2）合適的抗體稀釋度：抗體的濃度是免疫染色的關(guān)鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子遠遠多于抗原決定簇，可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少，產(chǎn)生陰性結(jié)果。此陰性結(jié)果并不一定缺少抗原，而是由于抗體過量。這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶效應(yīng)（Prozone effect）。因此，必須使用一系列稀釋或作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到zui大強度的特異性染色和zui弱的背景染色。抗體稀釋度應(yīng)根據(jù)：
①抗體效價，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；
②一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長；
③抗體中非特異性蛋白含量，只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；
④稀釋用緩沖液的種類、標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應(yīng)根據(jù)自己的情況測定。抗體的稀釋主要是指*抗體，因為*抗體中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵，應(yīng)用高稀釋度*抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng)，可減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。
　　（3）溫育時間：大部分抗體溫育時間為30-60min，必要時可4℃過夜（約18h）。溫育的溫度常用37℃，也可在室溫中進行，對抗原抗體反應(yīng)強的以室溫為佳。37℃可增強抗原抗體反應(yīng)，適用于多數(shù)抗體染色，但應(yīng)注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。
　　（4）多層染色法：對弱的抗原可用間接法（雙層）、PAP和ABC法（三層）、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯(lián)合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結(jié)果。
　　（5）顯色增敏劑的應(yīng)用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。
2．減少或消除非特異性染色的方法
組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，zui常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。zui有效方法是在用*抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1：5-1：20）封閉組織上帶電荷基團而除去與*抗體非特異性結(jié)合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色。作用時間為10-20min。也可用除制備*抗體以外的其它動物血清（非免疫的）。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文氏蘭（PBS溶液）稀釋熒光抗體，對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當然使用特異性高、效價高的*抗體是zui重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液，充分洗滌切片，能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。

如何判斷免疫細胞（組織）化學實驗的結(jié)果？
　　對免疫細胞化學結(jié)果的判斷應(yīng)持科學的慎重態(tài)度，要準確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結(jié)果，必須嚴格對照實驗。染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)；對新發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)果，除有對照試驗結(jié)果之外，應(yīng)進行多次重復(fù)實驗，要求用幾種方法進行驗證，如用PAP法陽性，可再用ABC法驗證。
　　必須學會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學者更為重要，否則會得出不科學的結(jié)論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應(yīng)產(chǎn)物常分布于特定的部位，如胞漿內(nèi)，也有分布在細胞核和細胞表面的，即具有結(jié)構(gòu)性。特異性染色表現(xiàn)為在同一切片上呈現(xiàn)不同程度的陽性染色結(jié)果。非特異性染色表現(xiàn)為無一定的分布規(guī)律，常為某一部位成片的均勻著色，細胞和周圍的結(jié)締組織均無區(qū)別的著色，或結(jié)締組織呈現(xiàn)很強的染色。非特異性染色常出現(xiàn)在干燥切片的邊緣，有刀痕或組織折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導(dǎo)致非特異性染色。有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結(jié)果的觀察和記錄，而且令人對其特異性結(jié)果產(chǎn)生懷疑。
　　陽性細胞具有如下的染色特征：
（1）陽性結(jié)果應(yīng)定位在細胞中相應(yīng)的部位，比如在細胞膜表達的抗原陽性結(jié)果應(yīng)定位在細胞膜上，在其他部位的陽性反應(yīng)均為非特異性染色。不當?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原在組織細胞中定位的改變。根據(jù)所檢測抗原的不同，抗原分別定位在：①細胞膜，如LCA和UCHL1等；②細胞質(zhì)，如Keratin和Lysozyme等；③細胞核，如PCNA和ER等。大部分抗原定位于細胞質(zhì)（胞漿），可見于整個胞漿或部分胞漿。
（2）陽性細胞分布可分為煙性和彌漫性。
（3）由于細胞內(nèi)含抗原量的不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性。
（4）陽性細胞染色定位于細胞，且與陰性細胞相互交雜分布；而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。
（5）切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域，壞死或擠壓的細胞區(qū)，膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強度，但絕大多數(shù)是非特異性染色，不能用于判斷陽性。