酶活性可分為全活性和比活性?xún)煞N。酶的全活性為每克干物質(zhì)每分鐘釋放的相應(yīng)糖的微摩爾(µmol)數(shù) , 單位為µmol/gDM
min。酶的比活性為每毫克蛋白每分鐘釋放的相應(yīng)糖的微摩爾(µmol)數(shù),單位為µmol/gProtein min。
全活性:取4支15ml試管,每支試管中加入1.5 mL.39℃預(yù)熱的2%羧甲基纖維素鈉(內(nèi)含0.1 mg/mL硫柳汞),其中1號(hào)試管為試劑空白,加入0.01 M,pH6.8磷酸鈉緩沖液1 ml;
2號(hào)試管為酶樣空白,什么也不加;3,4號(hào)試管為酶樣平行樣,各加入1 ml酶液,4支試管同時(shí)放入39℃水浴回旋震蕩培養(yǎng)60
min。培養(yǎng)后4支試管立即加入3 mL DNS (3,5-一硝基水楊酸溶液),再在2號(hào)試管中加入1 ml預(yù)先制備好的酶液,用旋渦震蕩儀混勻后在開(kāi)水浴中煮沸5
min,取出后用水冷卻5min。以1號(hào)試管為空白,在紫外分光光度計(jì)上560 nm處進(jìn)行比色。
以D-葡萄糖作為標(biāo)樣,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制:稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖1.00g,溶于100 mL容量瓶中,制成濃度為10
mg/mL葡萄糖溶液,再?gòu)闹幸来挝?,2,3,4,5,6 ml各溶于100
mL容量瓶中,制成濃度為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL溶液,吸取1.0 mL葡萄糖溶液加入3
mL DNS,煮沸5 min,冷卻5 min于560 nm處比色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
比活性:用考馬斯亮藍(lán)法確定酶液的蛋白濃度,使用牛血清白蛋白做標(biāo)樣。其他的與全活性相同。