免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測(cè)技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過(guò)氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

    辣根過(guò)氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡(jiǎn)稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過(guò)氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過(guò)水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過(guò)氧化物酶。

    是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。

    酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如，簡(jiǎn)稱HRP)國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。

制劑及其底物

    凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：

(1)來(lái)源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;

(3)酶活性和量能

    用簡(jiǎn)單方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

    由于(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。

    HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

    供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無(wú)色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

    由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過(guò)量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說(shuō)明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

    酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。常用過(guò)碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。