一、技術背景：
　　
　　Adeasy系統利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優點，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、的病毒載體。利用帶有E1基因的293細胞作為包裝細胞，通過倍比擴增，富集病毒顆粒，并通過CsCl梯度離心，透析進行分離純化。對絕大多數的細胞株可以達到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同樣具有所有病毒載體或轉染試劑都不可避免的細胞毒性問題。
　　
　　二、所需試劑：
　　
　　1.293細胞；
　　
　　2.重組好的腺病毒質粒；
　　
　　3.PacI限制性內切酶；
　　
　　4.質粒回收相關試劑；
　　
　　5.細胞培養、轉染相關試劑；
　　
　　6.TBS：10mMTris,0.9%NaCl，pH8.1；
　　
　　7.40%CsCl：28.45gCsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存；
　　
　　8.15%CsCl：9.085gCsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存；
　　
　　9.Beckman離心管：14*89mm，SW41轉頭；
　　
　　10.Polybrene（sigma），10mg/ml；
　　
　　11.透析袋：SpectrumCo.（成卷供應，帶少量甘油，硫化物與重金屬），MW=8000~14400；
　　
　　12.滅菌甘油。
　　
　　三、操作流程：
　　
　　1.293細胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells在轉染前24小時接種于1或2個60mm培養盤中，使之在轉染時細胞匯合率為50-70%；
　　
　　2.在轉染前，用PacI處理目的質粒（一般一個60mm細胞盤需要6μgDNA）。處理后質粒用乙醇沉淀并重懸于20μl無菌水中；
　　
　　3.用PEI或其他轉染試劑將6μgPacI處理過的質粒轉染細胞；
　　
　　4.8個小時后移去混合液，加入4mlDMEM*培養液（10%CBS，1%Pen/Strep）；
　　
　　5.在轉染后7到10天用細胞刮（而不是胰酶）將細胞從瓶中刮下并移入50ml錐形管。離心后將細胞重懸于2.0mlPBS或全培液中。于液氮中凍結細胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進行4次。注意保存時不要反復凍融，可保存于-20℃；
　　
　　6.將293細胞以50-70%的匯合率鋪于60mm培養盤中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明顯的細胞裂解或CPE現象；
　　
　　7.在有1/3到1/2的細胞脫離漂浮時，通常是感染后3-5天收集病毒。可進一步通過Westernblot或PCR（5μl病毒上清加上10μlPCR-gradeProteaseK，55℃消化1小時，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2μl進行PCR反應）證實重組腺病毒的存在；
　　
　　8.按步驟5的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到107infectiousparticles/ml的病毒。每輪的擴增應能提高一個數量級的梯度；
　　
　　9.為了進一步擴增，將步驟8獲得的病毒上清進一步感染100mm培養盤的細胞，按步驟5的方法收集病毒，并進而將其感染150mm細胞培養盤中的293細胞，以獲得足夠量的病毒；
　　
　　10.將15%CsCl和40%CsCl加入Beckman離心管中制備CsCl梯度溶液；
　　
　　11.將zui終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
　　
　　12.超速離心，30000rpm，4度離心16個小時；
　　
　　13.離心后，應有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16號針頭將這一條帶收集；
　　
　　14.在TBS中透析一小時，隨后在含有10％甘油的TBS中透析兩次，每次一小時；
　　
　　15.將純化的腺病毒分裝于EP管中；
　　
　　16.在EppendorfBiophotometer中測量透析液中的總蛋白量，1μg病毒蛋白相當于4×109病毒顆粒；
　　
　　17.長期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反復凍溶；
　　
　　18.由于腺病毒對不同細胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細胞毒副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細胞數1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細胞；加入相對培養液體積1：1000的Polybrene。在37度下平板離心30分鐘；
　　
　　19.感染8~12小時后換液。將含有病毒的培養液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液。
　　
　　詳情請看：腺病毒的包裝，純化和感染