Lowry比色法是蛋白質(zhì)測(cè)定zui靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用zui廣泛的一種方法,由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購(gòu)),近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的,只是加入了第二種試劑,即Folin—酚試劑,以增加顯色量,從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是:在堿性條件下,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原,產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下,蘭色深度與蛋白的量成正比。
Folin—酚試劑法zui早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,比雙縮脲法靈敏得多,缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng),要控制操作時(shí)間,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式,且專一性較差,干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子,同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%),硫酸納(1%),硝酸納(1%),三(0.5%),乙醇(5%),(5%),丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無(wú)影響,但這些物質(zhì)濃度高時(shí),必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液,只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高,顯色后會(huì)色淺,則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。
進(jìn)行測(cè)定時(shí),加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心,因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定,但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生,故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí),必須立即混勻,以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前,還原反應(yīng)即能發(fā)生。
此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
此法可檢測(cè)的zui低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。
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肝藥酶Lowry比色法測(cè)定