減少引物二聚體的方法
1. 從引物自身著手,重新設計引物,這是zui根本解決這一問題的辦法。
2. 可能模板有問題。
3. 模板濃度過小,適當加大模板量。
4. Taq酶,引物,Mg2+濃度可能過高,可降低它們的濃度。
5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘,然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻,這時再加入反應體系當中,引物二聚體就會消失的。
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增強特異性。
7. PCR反應體系的配制在冰上進行,zui后加TAq酶,PCR結束后,產物勿放置在室溫下過長時間,有人認為室溫下有些TAQ酶會將多余的引物合成為二聚體。
8. 增加循環數。
9. 降低退火溫度后有條帶,則應逐漸提高溫度,若提高溫度的同時產物量減少,則考慮增加鎂離子濃度(根據擴增片斷長度而定,片段長則相應鎂離子濃度應該高一些)。
10. 若降低退火溫度,發現還是只有引物二聚體,而且鎂離子的濃度在 20-25 mmol/l 沒有區別,則考慮Buffer等試劑沒有*融解、混勻,導致吸取的試劑濃度不對。
11. 以上次的pcr產物作模板二次pcr,可以提高引物與模板的特異性,減少引物二聚體,如果兩次時間間隔短的話,可以把原產物稀釋100-1000倍,如果間隔較長可以稀釋50-100倍。