培養基NK細胞的制備研究

1.NK 細胞的制備

　　1）制備NK 的方法參見*章之第四節。

　　2）懸浮NK 于接種培養液中，細胞濃度調至106/ml。

2.培養基接種NK 細胞

　　1）制備飼養細胞（PBMC）方法參見*章*節。

　　2）于4℃用300×g 離心飼養細胞12min。

　　3）被離心的飼養細胞懸浮于飼養培養液中，細胞濃度調至2×106/ml。

　　4）用強度5000radγ射線照射飼養細胞，于4℃用300×g 離心飼養細胞12min，將離心細胞再懸浮于飼養細胞培養液中，飼養細胞濃度調至2×106/ml。

　　5）在6 塊96 孔培養板的各孔中加100μl 上述飼養細胞懸液（總量用60ml 飼養細胞懸液，含1．2×108 個飼養細胞）。

　　6）將96 孔板置37℃孵箱預溫，直到加入NK 細胞。

　　7）將NK 細胞懸浮于接種培養基液中，并于預溫的96 孔板中加入100μlNK 細胞，使成為10 細胞/孔、5 細胞/孔和2．5 細胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復二塊板。

　　8）將培養板置5％CO2 孵箱中37℃培養。

3.NK 細胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養細胞）

　　1）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。

　　2）每孔中加入含有經照射的飼養細胞（2×106 細胞/ml）的NK 克隆培養液100μl。此培養液的制備方法如下：

　　（1）融化飼養細胞，移至50ml 試管中。

　　（2）輕輕地加入培養液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養細胞。

　　（3）用300×g 離心飼養細胞12min，并計數飼養細胞數量。

　　（4）按細胞計數結果，將飼養細胞懸浮于NK 克隆培養液中，調至細胞濃度為2×106/ml。

4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養液100μl。

5.檢測NK 細胞的生長狀況（9－10 天）如檢查有細胞生長，按第8 天的操作換液。

6.分離克隆（11－15 天）

　　1）當培養基液顏色變黃時，證明細胞已生長，在96 孔板上將生長的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養。

　　2）在96 孔板上擴增克隆，并重復第7 天的操作。