要求：

1）隨機六聚體引物：

當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難以拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2）Oligo(dT)：

是一種僅對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA只占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。特別適合檢測多個基因的表達，這樣可以節約反轉錄的試劑，cDNA可以多次使用，可用于檢測稀有基因是否表達、從極少量細胞中定量檢測特定mRNA的表達水平。

3）特異性引物：

特異的反轉錄方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，條鏈的合成可由與mRNA3’端靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

做 Real Time PCR時，用于SYBR Green I/Eva Green 法時的一對引物與一般PCR的引物，在引物設計上所要求的參數是不同的。引物設計的要求： 

① Tm=55-65℃

② GC=30-80% 

③ PCR擴增產物長度：引物的產物大小不要太大，一般在80-300bp之間都可。 

④ 引物的退火溫度要高，一般要在 60℃以上。

要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴增的存在。而且引物設計時應該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應該跨外顯子，是引物能跨外顯子的接頭區，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。

至于設計軟件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMER EXPRESS都應該可以的。做染料法關鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準備---尋找合適的引物非常不易。

五、cDNA與引物質量檢測

取0.2ml薄壁PCR管，編號。向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物濃度10uM） ，向管中加入混合的cDNA各1ul。各管補加水至20ul。