細(xì)胞傳代問題分析：

　　1、傳代密度過高

　　一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過高(>90%)才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時(shí)不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤傳代，細(xì)胞也無法回到原本的特性了。(如：單層細(xì)胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)。

　　解決方案：

　　盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤。

　　細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。

　　2、傳代密度過低

　　哺乳動(dòng)物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長因子濃度會(huì)不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會(huì)造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。

　　解決方案：

　　細(xì)胞傳代時(shí)，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保鋪盤的密度。

　　3、凍 存

　　細(xì)胞凍存的基本原理：慢凍

　　手動(dòng)降溫：將細(xì)胞依序放在4℃(30分鐘)、-20℃(1小時(shí))、-80℃(過夜)后移至液氮中保存。

　　程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱)，使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過夜)，然后移至液氮中保存。

　　由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動(dòng)降溫。

　　部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過程中雖然會(huì)保護(hù)細(xì)胞，但它們也會(huì)引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會(huì)含有血清，血清是用來降低細(xì)胞毒性的，但血清也不是完整的。