逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR） 的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。

實驗步驟：

一、總 RNA 的提取

按照總 RNA 提取實驗步驟提取組織或細(xì)胞中的總 RNA。

二、cDNA 第一鏈的合成

目前試劑公司有多種 cDNA 第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現(xiàn)以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

在 0.5 ml 微量離心管中，加入總 RNA 1～5 μg，補充適量的 DEPC H2O 使總體積達(dá) 11 μl。在管中加 10 μM Oligo（dT）12～18 1 μl，輕輕混勻、離心；

70℃ 加熱 10 min，立即將微量離心管插入冰浴中至少 1 min；

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl。輕輕混勻，離心。42℃ 孵育 2～5 min；

加入 SuperscriptⅡ1 μl ,在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

于 70℃ 加熱 15 min 以終止反應(yīng)；

將管插入冰中，加入 RNase H 1 μl，37 ℃ 孵育 20 min，降解殘留的 RNA。-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?br/>

三、PCR

取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列試劑：第一鏈 cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP（2 mM） 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；

加入適量的 ddH2O，使總體積達(dá) 50 μl。輕輕混勻，離心；

設(shè)定 PCR 程序。在適當(dāng)?shù)臏囟葏?shù)下擴增 28～32 個循環(huán)。為了保證實驗結(jié)果的可靠與準(zhǔn)確，可在 PCR 擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如 G3PD）的特異性引物，同時擴增內(nèi)參 DNA，作為對照；

電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果；

密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。