肺炎支原體(MHP)核酸擴(kuò)增檢測試劑盒
試劑盒選取一對肺炎支原體(MHP)特異性引物和一條特異性熒光探針，應(yīng)用堿裂解法提取肺炎支原體(MHP)DNA，后者在耐熱DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR-熒光探針體外擴(kuò)增法對肺炎支原體(MHP)進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到快速檢測定量之目的。
標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸
1.適用標(biāo)本：發(fā)病動(dòng)物（豬、牛、羊等）呼吸道分泌物或尸檢動(dòng)物肺、淋巴結(jié)等組織標(biāo)本等。
2.標(biāo)本采集：
呼吸道分泌物：用無菌棉試子深擦疑似動(dòng)物的喉頭或鼻腔，采集呼吸道分泌物，后轉(zhuǎn)至一盛有1-3ml生理鹽水(或PBS)的5ml離心管中，密閉送檢。
肺、淋巴結(jié)等固體組織：無菌條件下采取具有特征的肺臟或淋巴結(jié)等組織500mg，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml離心管中，密閉送檢。
3.保存和運(yùn)輸：述處理后的標(biāo)本可保存于-20℃，保存期為6個(gè)月，-70℃可長期保存。運(yùn)送應(yīng)采用0℃冰壺。
2PCR擴(kuò)增
從試劑盒中取出MHP–PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對照+4管陽性對照），每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 MHP–PCR MIX Taq酶系
用量 24μl 2μl
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入26μl，向每管中加入處理后樣品(所獲得的DNA樣品)或MHP–陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品(使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和陰性質(zhì)控品4μl，10,000rpm瞬時(shí)離心30秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對應(yīng)順序設(shè)置陰性控品，陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體積(30μl)、樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA)和循環(huán)條件：
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器：循環(huán)條件：94→2分鐘，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40個(gè)循環(huán)。
使用方法
1DNA提取
1.1標(biāo)本預(yù)處理
1.1.1呼吸道分泌物：將標(biāo)本充分混勻，擠干棉試子，取1ml試子液轉(zhuǎn)至1.5ml干凈離心管， 13,000rpm離心5分鐘，棄上清，保留沉淀。
1.1.2肺臟、淋巴結(jié)等固體組織：取200mg組織加入1ml生理鹽水，采用液氮或研磨器充分研磨成組織勻漿，取50μl勻漿液，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml干凈離心管中。
1.1.3陰性質(zhì)控品：取50μl陰性質(zhì)控品轉(zhuǎn)至1.5ml干凈離心管。
1.2 DNA提取：向上述標(biāo)本中加入50μl核酸提取液B充分混勻，100℃烈解10min。13,000rpm 離心3min，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。
陰性質(zhì)控品：取50 μl陰性質(zhì)控品加入50μl核酸提取液B，充分震蕩。后100℃裂解10分鐘，然后13,000rpm離心3分鐘，取上清液4μl做PCR反應(yīng)。
MHP陽性質(zhì)控品：直接取4μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。或按照PCR擴(kuò)增介紹方法進(jìn)行定量分析。
LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件：94→2分鐘，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40個(gè)循環(huán)。
3．結(jié)果分析判定
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到*（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值（Qty-Copies/ml）。
質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：全部陰性。
MHP陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品的 Ct 值均應(yīng)小于 35.0。
∣r∣≥0.97（correlation數(shù)值介于-0.97~-1之間，correlation數(shù)值等同于∣r∣值）。
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足 ，否則，此次試驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。
結(jié)果判定
測定結(jié)果的計(jì)算：
如果Ct值﹤38，則實(shí)驗(yàn)樣品的MHP DNA含量(基因拷貝數(shù)/ml)= Qty-Copies/ml。
如果38﹤Ct值﹤40,為灰區(qū)建議重新檢測，重新檢測若38﹤Ct值﹤40判為陽性，否則為陰性。
如果Ct值=40，則MHP DNA含量（基因拷貝數(shù)/ml）﹤1×10P2PCopies/ml (低于檢測下限)。
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H838細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞 LTEP-s細(xì)胞
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 LTEP-sm細(xì)胞
人肺鱗癌瘤株 LTEP-s細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞 NCI-H1703細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞 NCI-H2170細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H524細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞 SPC-A1細(xì)胞
人肺癌細(xì)胞 A549細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 H125細(xì)胞
人肺癌細(xì)胞 H1299細(xì)胞
人肺癌細(xì)胞 TKB-1細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞，LTEP-a-2細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞，Lu-165細(xì)胞
人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H460細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞，SPC-A-1細(xì)胞
人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞，095-D細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞，SK-MES-1細(xì)胞
人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H661細(xì)胞
人肺黏液上皮樣癌細(xì)胞，NCI-H292細(xì)胞
人肺退行性癌細(xì)胞，Calu-6細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞，NCI-H1395細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H358細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，HCC827細(xì)胞
人典型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H1688細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，NCI-H1299細(xì)胞
人胚肺二倍體細(xì)胞，2BS細(xì)胞
人支氣管上皮樣細(xì)胞，BEAS-2B細(xì)胞
人肺腺癌細(xì)胞 Calu-3細(xì)胞
人胚肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞 SL-1細(xì)胞
人支氣管上皮樣細(xì)胞 BEAS-2B細(xì)胞
人胚肺二倍體細(xì)胞 HEL-2細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞 NCI-H226細(xì)胞
人肺轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 AE1201細(xì)胞
人胚肺細(xì)胞系 KuMA細(xì)胞
人胚肺二倍體細(xì)胞 HEL-1細(xì)胞
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 DMS 153細(xì)胞
人肺細(xì)胞 HLF-a細(xì)胞
人胚肺二倍體細(xì)胞 KMB-17細(xì)胞
人胚肺二倍體細(xì)胞 2BS細(xì)胞
人胚胎肺成纖維細(xì)胞 WI-38細(xì)胞
人胚胎氣管組織來源細(xì)胞 CCC-HBE-2細(xì)胞
人胚肺成纖維細(xì)胞 CCC-HPF-1細(xì)胞
MRC-5細(xì)胞--MRC-5細(xì)胞 細(xì)胞株
人胚肺成纖維細(xì)胞 MRC-5細(xì)胞 細(xì)胞株
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H209細(xì)胞
人低分化肺腺癌細(xì)胞 GLC-82細(xì)胞
人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 NCI-H446細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞 NCI-H157細(xì)胞
人肺鱗癌細(xì)胞 NCI-H520細(xì)胞
人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 PG-BE1細(xì)胞
人肺巨細(xì)胞癌低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株 PG-LH7細(xì)胞
人肺癌細(xì)胞 A-427細(xì)胞
人低分化肺腺癌細(xì)胞 SK-LU-1細(xì)胞
人肺支氣管癌細(xì)胞 NCI-H1650細(xì)胞
人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞 NCI-H1975細(xì)胞
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